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摘要：目的： 了解瑞安市副溶血性弧菌临床分离株的血清型和毒力基因携带情况。方法： 按照国标GB 4789.7-2013进行血清分型，用PCR方法检测其tdh和trh毒力基因。结果： 52株副溶血性弧菌的O血清型，以O3（42.30%）、O4（30.77%）、O1（11.54%）为主，28株K型不能分型；41株菌株tdh+trh-，4株tdh-trh+，1株tdh+trh+，6株tdh-trh-；所有trh+菌株尿素酶试验阳性。结论 ：瑞安地区副溶血性弧菌临床分离株中O3：K6为最主要的流行血清型，O4：KUT次之；大部分菌株携带tdh毒力基因。
关键词： 副溶血性弧菌；毒力基因；尿素酶；血清分型
副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus， Vp）是一种广泛分布于近海岸的海水、海底泥沙、浮游生物和海产品中的一种嗜盐性弧菌。它是引起我国沿海地区食物中毒的重要致病菌。耐热直接溶血素（TDH）和TDH相关溶血素（TRH）是目前公认的副溶血性弧菌主要的毒力因子，与其致病能力密切相关[1]。本文对分离至腹泻病人的副溶血性弧菌临床分离株进行血清学分型，并将TDH毒力基因（tdh）和TRH毒力基因（trh）进行PCR检测，分析毒力基因在临床分离株中的携带分布情况。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 2013年至2014年本实验室从临床腹泻病人肛拭子分离到的副溶血性弧菌，共52株。
1.1.2 主要试剂 尿素酶培养基购自北京陆桥技术股份有限公司。副溶血性弧菌O诊断血清及K诊断血清购自日本生研株式会社。PCR引物合成和相关试剂购自生工生物工程（上海）股份有限公司。引物序列见表1。
1.2 方法
1.2.1 尿素酶试验 将待测菌株接种于尿素培养基，37℃培养24小时。培养基颜色变为玫红色，则为阳性反应，不变色则为阴性。
1.2.2 副溶血性弧菌血清分型 参照GB 4789.7-2013进行[2]。
1.2.3 副溶血性弧菌毒力基因分析
1.2.3.1模板DNA制备：用接种环挑取1-2环纯培养物于150μl无菌纯水中混匀，100℃煮沸10分钟，12000r/min离心10min，取上清液保存于-20℃备用。
1.2.3.2 PCR反应体系：2×PCR预混体系25μl，20μmol/L上下游引物各1μl，双蒸水21μl，模板2μl，终体系为50μl。扩增条件为94℃预变性5min，然后按94℃变性1min，55℃退火1min（tl基因为58℃），72℃延伸1min，循环30次，最终72℃延伸5min。用双蒸水做阴性对照，用阳性菌种ATCC33847（tdh+ trh- tl+）和ATCC17802（tdh- trh+ tl+）的DNA做阳性对照。
1.2.3.3 PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析：分别取5μlPCR产物和DNAmarker于1%琼脂糖凝胶上进行电泳。
表1 PCR引物序列、退火温度及产物大小
注：tl基因为副溶血性弧菌的种属特异性基因
2 结果
2.1 副溶血弧菌血清型分布情况
52株副溶血性弧菌中，检出O3血清群22株（42.30%），占比最大，其中O3：K6有19株，O3：KUT（K型不能分型）占3株；O4群16株（30.77%），其中O4：KUT有14株，O4：K4，O4：K8各一株；O1群6株（11.54%），K型均为不能分型；O10群4株（7.69%），O10：K60有3株，1株K型不能分型；O5群3株（5.77%），K型均为不能分型；O8群1株，K型不能分型，详见表2。未检测到O2，O6，O7，O9，O11血清型。超过半数的菌株K型不能分型（28/52）。
表2 副溶血性弧菌血清型分布和毒力基因携带情况
2.2 毒力基因检测及尿素酶试验结果
经PCR检测，所有菌种均携带tl基因，确定为副溶血性弧菌。携带tdh基因而不携带trh基因的菌株（tdh+trh-）占41株（73.85%），tdh-trh+占4株（7.69%），tdh-trh-占6株（11.54%），tdh+trh+占1株（1.92%），其血清型为O10：KUT，见表2。部分样本tdh、trh基因扩增电泳图见图1。5株trh基因阳性的菌株其尿素酶试验呈阳性，其余菌株尿素酶试验阴性。
图1 部分副溶血性弧菌tdh、trh基因PCR扩增电泳图
3 讨论
本研究对52株分离自腹泻病人的副溶血性弧菌的血清型分析表明，O3：K6是本地副溶血性弧菌临床分离株的主要血清型，O4：KUT其次，O1：KUT列第三。近年来，除了O3：K6外，O4：K48，O4：K68，O1：K25和O1：KUT引起多次肠炎爆发，这几种血清型被认为是流行血清型。本研究中出现的占第二位的O4：KUT血清型，已然成为本地区重要的血清型，其K型不能分型。相比较瑞安市分离自水产品中的副溶血性弧菌，排名前三位的血清型为O1群（20.33%）、O3群（16.95%）、O5群（15.25%），而O4群仅占5.08%[3]。这两项结果对比表明，瑞安地区不同来源的副溶血性弧菌其血清型构成不同。在水产品中，占比较低的O4群，为何在腹泻病人中成为优势血清型，这一机制需要再做深入的研究。
本次研究中，超过半数的菌株K型不能分型，在以后的监测中，应该引起注意。传统的血清分型技术由于其分辨力较低且易受环境及培养条件的影响，在追踪传染源以及确定暴发型感染菌株特征等方面受到了制约[4]。基于分子生物学手段的基因分型技术，将有助于细菌分型和传染源的追踪。
副溶血性弧菌的致病性源于侵袭性、溶血素和尿素酶。环境分离株极少携带tdh或trh，而临床分离株通常携带tdh或trh，或二者兼有。本研究显示52株临床分离株中毒力基因总携带率高达88.46%，携带双毒力基因的有1例。本地区分离自海产品中的副溶血性弧菌的毒力基因携带率仅为4.65%（2/43）[5]，这一现象与其他学者的研究相符合[4]。Okuda等[6]发现尿素酶阳性株均携带有trh基因，而trh基因阳性株也都具有尿素酶活性，两者之间存在密切关联。本文中5株trh阳性株其尿素酶试验阳性，其余47株尿素酶试验均为阴性。值得注意的是，有6例菌株不携带tdh或trh基因中的任何一种，深圳、杭州等地亦有出现不携带tdh或trh基因的副溶血性弧菌临床分离株，提示可能还有其他毒素引起致病，需要再做进一步的研究。
参考文献：
[1] 蔡潭溪，蒋鲁岩，黄克和. 副溶血弧菌的分子生物学研究进展[J]. 中国人兽共患病杂志，2005，21（10）：914-915.
[2] GB 4789.7-2013. 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验[S].
[3] 叶环环，刘敏芝，周邦瑶，等. 瑞安市零售水产品中副溶血性弧菌的血清分型鉴定[J]. 中国保健营养，2013，23（5）：886.
[4] 刘李，许欣，段永翔，等. 深圳市副溶血性弧菌血清型及其毒力基因特征研究[J]. 中国热带医学，2009，9（8）：1399-1340.
[5] 黄棉汝，李娜，叶环环，等. 生食腌制海产品中副溶血性弧菌的血清分型和耐药性分析[J]. 中国卫生检验杂志，2014，24（1）：2779-2082.
关键词： 副溶血性弧菌；毒力基因；尿素酶；血清分型
副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus， Vp）是一种广泛分布于近海岸的海水、海底泥沙、浮游生物和海产品中的一种嗜盐性弧菌。它是引起我国沿海地区食物中毒的重要致病菌。耐热直接溶血素（TDH）和TDH相关溶血素（TRH）是目前公认的副溶血性弧菌主要的毒力因子，与其致病能力密切相关[1]。本文对分离至腹泻病人的副溶血性弧菌临床分离株进行血清学分型，并将TDH毒力基因（tdh）和TRH毒力基因（trh）进行PCR检测，分析毒力基因在临床分离株中的携带分布情况。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 2013年至2014年本实验室从临床腹泻病人肛拭子分离到的副溶血性弧菌，共52株。
1.1.2 主要试剂 尿素酶培养基购自北京陆桥技术股份有限公司。副溶血性弧菌O诊断血清及K诊断血清购自日本生研株式会社。PCR引物合成和相关试剂购自生工生物工程（上海）股份有限公司。引物序列见表1。
1.2 方法
1.2.1 尿素酶试验 将待测菌株接种于尿素培养基，37℃培养24小时。培养基颜色变为玫红色，则为阳性反应，不变色则为阴性。
1.2.2 副溶血性弧菌血清分型 参照GB 4789.7-2013进行[2]。
1.2.3 副溶血性弧菌毒力基因分析
1.2.3.1模板DNA制备：用接种环挑取1-2环纯培养物于150μl无菌纯水中混匀，100℃煮沸10分钟，12000r/min离心10min，取上清液保存于-20℃备用。
1.2.3.2 PCR反应体系：2×PCR预混体系25μl，20μmol/L上下游引物各1μl，双蒸水21μl，模板2μl，终体系为50μl。扩增条件为94℃预变性5min，然后按94℃变性1min，55℃退火1min（tl基因为58℃），72℃延伸1min，循环30次，最终72℃延伸5min。用双蒸水做阴性对照，用阳性菌种ATCC33847（tdh+ trh- tl+）和ATCC17802（tdh- trh+ tl+）的DNA做阳性对照。
1.2.3.3 PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析：分别取5μlPCR产物和DNAmarker于1%琼脂糖凝胶上进行电泳。
表1 PCR引物序列、退火温度及产物大小
注：tl基因为副溶血性弧菌的种属特异性基因
2 结果
2.1 副溶血弧菌血清型分布情况
52株副溶血性弧菌中，检出O3血清群22株（42.30%），占比最大，其中O3：K6有19株，O3：KUT（K型不能分型）占3株；O4群16株（30.77%），其中O4：KUT有14株，O4：K4，O4：K8各一株；O1群6株（11.54%），K型均为不能分型；O10群4株（7.69%），O10：K60有3株，1株K型不能分型；O5群3株（5.77%），K型均为不能分型；O8群1株，K型不能分型，详见表2。未检测到O2，O6，O7，O9，O11血清型。超过半数的菌株K型不能分型（28/52）。
表2 副溶血性弧菌血清型分布和毒力基因携带情况
2.2 毒力基因检测及尿素酶试验结果
经PCR检测，所有菌种均携带tl基因，确定为副溶血性弧菌。携带tdh基因而不携带trh基因的菌株（tdh+trh-）占41株（73.85%），tdh-trh+占4株（7.69%），tdh-trh-占6株（11.54%），tdh+trh+占1株（1.92%），其血清型为O10：KUT，见表2。部分样本tdh、trh基因扩增电泳图见图1。5株trh基因阳性的菌株其尿素酶试验呈阳性，其余菌株尿素酶试验阴性。
图1 部分副溶血性弧菌tdh、trh基因PCR扩增电泳图
3 讨论
本研究对52株分离自腹泻病人的副溶血性弧菌的血清型分析表明，O3：K6是本地副溶血性弧菌临床分离株的主要血清型，O4：KUT其次，O1：KUT列第三。近年来，除了O3：K6外，O4：K48，O4：K68，O1：K25和O1：KUT引起多次肠炎爆发，这几种血清型被认为是流行血清型。本研究中出现的占第二位的O4：KUT血清型，已然成为本地区重要的血清型，其K型不能分型。相比较瑞安市分离自水产品中的副溶血性弧菌，排名前三位的血清型为O1群（20.33%）、O3群（16.95%）、O5群（15.25%），而O4群仅占5.08%[3]。这两项结果对比表明，瑞安地区不同来源的副溶血性弧菌其血清型构成不同。在水产品中，占比较低的O4群，为何在腹泻病人中成为优势血清型，这一机制需要再做深入的研究。
本次研究中，超过半数的菌株K型不能分型，在以后的监测中，应该引起注意。传统的血清分型技术由于其分辨力较低且易受环境及培养条件的影响，在追踪传染源以及确定暴发型感染菌株特征等方面受到了制约[4]。基于分子生物学手段的基因分型技术，将有助于细菌分型和传染源的追踪。
副溶血性弧菌的致病性源于侵袭性、溶血素和尿素酶。环境分离株极少携带tdh或trh，而临床分离株通常携带tdh或trh，或二者兼有。本研究显示52株临床分离株中毒力基因总携带率高达88.46%，携带双毒力基因的有1例。本地区分离自海产品中的副溶血性弧菌的毒力基因携带率仅为4.65%（2/43）[5]，这一现象与其他学者的研究相符合[4]。Okuda等[6]发现尿素酶阳性株均携带有trh基因，而trh基因阳性株也都具有尿素酶活性，两者之间存在密切关联。本文中5株trh阳性株其尿素酶试验阳性，其余47株尿素酶试验均为阴性。值得注意的是，有6例菌株不携带tdh或trh基因中的任何一种，深圳、杭州等地亦有出现不携带tdh或trh基因的副溶血性弧菌临床分离株，提示可能还有其他毒素引起致病，需要再做进一步的研究。
参考文献：
[1] 蔡潭溪，蒋鲁岩，黄克和. 副溶血弧菌的分子生物学研究进展[J]. 中国人兽共患病杂志，2005，21（10）：914-915.
[2] GB 4789.7-2013. 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验[S].
[3] 叶环环，刘敏芝，周邦瑶，等. 瑞安市零售水产品中副溶血性弧菌的血清分型鉴定[J]. 中国保健营养，2013，23（5）：886.
[4] 刘李，许欣，段永翔，等. 深圳市副溶血性弧菌血清型及其毒力基因特征研究[J]. 中国热带医学，2009，9（8）：1399-1340.
[5] 黄棉汝，李娜，叶环环，等. 生食腌制海产品中副溶血性弧菌的血清分型和耐药性分析[J]. 中国卫生检验杂志，2014，24（1）：2779-2082.