论文部分内容阅读
（1.河北大学生命科学学院，药物化学与分子诊断教育部重点实验室，河北保定 071002;2.河北大学药学院，药物质量控制河北省重点实验室，河北保定 071002）
摘要[目的]对虫生真菌环链棒束孢（Isaria cateniannulata）的次级代谢产物进行分离并研究其抗肿瘤活性。[方法]采用溶剂萃取、硅胶柱色谱、凝胶Sephadex LH-20等方法进行分离纯化，根据理化性质和波谱技术对分离得到的化合物进行结构鉴定，利用MTT法对化合物的抗肿瘤活性进行测试。[结果]从虫生真菌Isaria cateniannulata中共分离得到8个化合物，分别为β-麦角甾醇、豆甾-4-烯-3-酮、5α，8β-过氧-（22E，24R）-麦角甾-6，22-二烯3β-醇、4-methyl-5，6-dihydro-2H-pyran-2-one、（R）-甲羟戊酸内酯、对羟基苯甲醛、β-石竹烯和石竹烯氧化物。除化合物4外，其余化合物均是从该种中首次分离得到。抗肿瘤结果显示，化合物7、8对肿瘤细胞具有一定的抑制能力。[结论]该研究为新的抗肿瘤药物开发方面提供了广阔空间。
关键词虫生真菌;环链棒束孢;倍半萜类化合物;抗肿瘤活性;结构鉴定
中图分类号R284.1文献标识码A
文章编号0517-6611（2019）03-0196-03
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.03.061
环链棒束孢（Isaria cateinannulata）是棒束孢属中的一种非常重要的虫生病原菌，而且在自然界中分布广泛[1]。对该属的研究主要以玫烟色棒束孢和粉棒束孢为主，而对环链棒束孢研究较少。到目前为止，对于环链棒束孢的报道较多集中在植物病虫害防治领域，朱新燕等[2]对环链棒束孢不同菌株的固体培养条件进行研究;刘爱英[3]就环链棒束孢对于几种昆虫的治病效果进行研究，但对于环链棒束孢的次级代谢产物的系统研究鲜见报道。笔者为了寻找新型的具有抗肿瘤活性的化合物，采用溶剂萃取、硅胶柱色谱、凝胶Sephadex LH-20等方法对虫生真菌环链棒束孢进行分离纯化，根据理化性质和波谱技术对分离得到的化合物进行结构鉴定，并利用MTT法对化合物的抗肿瘤活性进行测试。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1仪器。旋转蒸发仪R-210（瑞士BUCHI公司）;核磁共振儀AM-600（德国BRUKER公司）;双层恒温摇床ZHWY（上海智城分析仪器有限公司）;超净工作台ZHJH-C1112C（上海智城分析仪器有限公司）;薄层层析硅胶板（烟台化学工业研究所）;柱层析硅胶（200～400目，烟台化学工业研究所）;Sephadex LH-20（瑞典GE Healthcare公司）。
1.1.2培养基。PDA培养基：葡萄糖40 g，去皮土豆400 g，加蒸馏水至2 000 mL，pH 6.5。大米固体培养基：100 mL蒸馏水，80 g大米。
1.1.3
试验菌株。该试验所用菌种为环链棒束孢（Isaria cateniannulata），购自安徽农业大学，保存于河北大学药物化学与分子诊断重点实验室菌种库。
1.1.4
供试肿瘤细胞株。人肝癌细胞（Huh-7）、人宫颈癌细胞（Hela）、人胃癌细胞（MGC-803）、人乳腺癌细胞（MCF-7）以及人肺癌细胞（A549）在-196 ℃液氮中冻存。
1.2试验方法
1.2.1
发酵与分离。将Isaria cateniannulata菌种接种到PDA液体培养基中，于26 ℃、150 r/min恒温摇床中培养6 d，得到3 L种子液。将3 L种子液以10%的接种量接种到大米培养基中（共30 L），室温培养30 d，得到固体发酵物。
将Isaria cateniannulata的大米发酵物收集，以1.5倍的体积加入乙酸乙酯萃取，每次浸泡48 h，共萃取6次，合并萃取液，减压浓缩得到浸膏107 g。将107 g浸膏与等体积硅胶拌匀，室温下干燥。进行加压柱层析，用石油醚/乙酸乙酯系统梯度洗脱[100∶0、20∶1、15∶1、10∶1、8∶1、6∶1、4∶1、2∶1、1∶1（V/V）]，经TCL检测之后合并，得到Fr1～Fr5共5个部分。经反复硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶过滤、薄层TLC制备以及重结晶后得到化合物1～8。
1.2.2
活性筛选。将5个细胞株取出，置于37 ℃水浴锅复苏，待其解冻后吸出细胞悬液分别放入4个培养瓶中，加入细胞培养液。置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养。传代培养3次，每3 d传代一次，使细胞恢复健康状态。胰酶消化细胞：用3 mL PBS清洗一次细胞，然后加入1 mL胰酶，37 ℃孵育1～3 min，终止消化。在96孔板中每孔接种100 μL，其含有8 000个细胞。第2天，观察细胞密度，待细胞培养至汇合率80%左右，加药处理。分别将化合物7、8母液进行梯度式稀释，每孔加入2 μL各浓度样品稀释液，使其作用浓度分别为100.00、50.00、25.00、12.50、6.25 μL，每组设3个平行，同时设置阴性对照。样品处理细胞24 h，避光每孔均加入20 μL MTT溶液。37 ℃培养箱中孵育4 h，然后每孔加入100 μL SDS-HCl，孵育过夜。在酶标仪SpectraMax M2上测试各孔570 nm的吸光度值。
抑制率=[（对照组OD570-样品处理组OD570）/对照组OD570]×100%，根据寇式改良公式计算各个样品相应细胞株的IC50，即死亡细胞数与总细胞之比为50%时所对应的样品浓度。 2结果与分析
2.1结构鉴定该试验通过对Isaria cateniannulata进行大米发酵培养，从其乙酸乙酯的萃取物中共分离到8个化合物，分别为化合物1（62.7 mg）、化合物2（22.7 mg）、化合物3（11.2 mg）、化合物4（9.7 mg）、化合物5（13.3 mg）、化合物6（21.5 mg）、化合物7（11.4 mg）、化合物8（2.2 mg）。化合物的结构见图1。
2.2活性测试结果
对从虫生真菌中分离得到的化合物7、8利用MTT法进行抗肿瘤活性测试。测试细胞分别为人胃癌细胞（MGC-803）、人乳腺癌细胞（MCF-7）、人肝癌细胞（Huh-7）、人宫颈癌细胞（Hela）和人肺癌细胞（A549），试验结果如表1。从表1可以看出，化合物7对A549的半抑制浓度值（IC50）为80.44 μg/mL，表明化合物7对A549有一定的抑制作用;化合物8对MGC-803、MCF-7、Huh-7和Hela的IC50值分别为54.88、84.21、61.94、72.99 μg/mL，表明化合物8对Huh-7、Hela、MGC-803和MCF-7具有一定的抑制能力，但抑制能力较弱。
3结论
该研究对虫生真菌环链棒束孢Isaria cateniannulata的次级代谢产物进行分离鉴定，共分离鉴定出8种化合物，分别为β-麦角甾醇、豆甾-4-烯-3-酮、5α，8β-过氧-（22E，24R）-麦角甾-6，22-二烯3β-醇、4-methyl-5，6-dihydro-2H-pyran-2-one、（R）-甲羟戊酸内酯、对羟基苯甲醛、β-石竹烯和石竹烯氧化物，其中8种化合物均为首次从该种中分离得到。对化合物7、8进行抗肿瘤活性测试，结果顯示，化合物7对A549具有一定的抑制能力，化合物8对Huh-7、Hela、MGC-803和MCF-7具有一定的抑制能力，但是抑制能力均较弱。
安徽农业科学2019年
参考文献
[1] 张德龙，王小董，陆瑞利，等.液体或固体培养对环链棒束孢（Isaria cateinannulata）菌丝体中挥发性成分组成的影响[J].微生物学报，2011，51（12）：1616-1624.
[2] 朱新燕，李增智，樊美珍，等.3株环链拟青霉固体培养条件的研究[J].安徽农业大学学报，2008，35（1）：38-41.
[3] 刘爱英，陈月碧，梁宗琦，等.环链拟青霉和玫烟色拟青霉对菜青虫致病条件的研究[J].贵州农业科学，1982（1）：57-59.
[4] 万辉.褐圆孔牛肝菌化学成分的研究[J].中草药，2000，31（5）：328-330.
[5] 李小军，袁燕，李芝，等.苗药冠盖藤的化学成分研究[J].中草药，2014，45（8）：1052-1055.
[6] 和东阳，王利勤.神黄豆果实化学成分的研究[J].中国现代应用药学，2014，31（11）：1355-1359.
[7] YING Y M，ZHANG L W，SHAN W G，et al.Secondary metabolites of Peyronellaea sp.XW-12，an endophytic fungus of Huperzia serrata[J].Chem Nat Compd，2014，50（4）：723-725.
[8] 胡琳，丁智慧，刘吉开.灰黑拟牛肝菌的化学成分[J].云南植物研究，2002，24（5）：667-670.
[9] RAGASA C Y，ESPINEI D L，AGOO E M G，et al.Chemical constituents of Cinnamomum cebuense[J].Chin J Nat Med，2013，11（3）：264-268.
[10] RAGASA C Y，GANZON J，HOFILEA J，et al.A new furanoid diterpene from Caesalpinia pulcherrima[J].Chem Pharm Bull，2003，51（10）：1208-1210.
摘要[目的]对虫生真菌环链棒束孢（Isaria cateniannulata）的次级代谢产物进行分离并研究其抗肿瘤活性。[方法]采用溶剂萃取、硅胶柱色谱、凝胶Sephadex LH-20等方法进行分离纯化，根据理化性质和波谱技术对分离得到的化合物进行结构鉴定，利用MTT法对化合物的抗肿瘤活性进行测试。[结果]从虫生真菌Isaria cateniannulata中共分离得到8个化合物，分别为β-麦角甾醇、豆甾-4-烯-3-酮、5α，8β-过氧-（22E，24R）-麦角甾-6，22-二烯3β-醇、4-methyl-5，6-dihydro-2H-pyran-2-one、（R）-甲羟戊酸内酯、对羟基苯甲醛、β-石竹烯和石竹烯氧化物。除化合物4外，其余化合物均是从该种中首次分离得到。抗肿瘤结果显示，化合物7、8对肿瘤细胞具有一定的抑制能力。[结论]该研究为新的抗肿瘤药物开发方面提供了广阔空间。
关键词虫生真菌;环链棒束孢;倍半萜类化合物;抗肿瘤活性;结构鉴定
中图分类号R284.1文献标识码A
文章编号0517-6611（2019）03-0196-03
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.03.061
环链棒束孢（Isaria cateinannulata）是棒束孢属中的一种非常重要的虫生病原菌，而且在自然界中分布广泛[1]。对该属的研究主要以玫烟色棒束孢和粉棒束孢为主，而对环链棒束孢研究较少。到目前为止，对于环链棒束孢的报道较多集中在植物病虫害防治领域，朱新燕等[2]对环链棒束孢不同菌株的固体培养条件进行研究;刘爱英[3]就环链棒束孢对于几种昆虫的治病效果进行研究，但对于环链棒束孢的次级代谢产物的系统研究鲜见报道。笔者为了寻找新型的具有抗肿瘤活性的化合物，采用溶剂萃取、硅胶柱色谱、凝胶Sephadex LH-20等方法对虫生真菌环链棒束孢进行分离纯化，根据理化性质和波谱技术对分离得到的化合物进行结构鉴定，并利用MTT法对化合物的抗肿瘤活性进行测试。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1仪器。旋转蒸发仪R-210（瑞士BUCHI公司）;核磁共振儀AM-600（德国BRUKER公司）;双层恒温摇床ZHWY（上海智城分析仪器有限公司）;超净工作台ZHJH-C1112C（上海智城分析仪器有限公司）;薄层层析硅胶板（烟台化学工业研究所）;柱层析硅胶（200～400目，烟台化学工业研究所）;Sephadex LH-20（瑞典GE Healthcare公司）。
1.1.2培养基。PDA培养基：葡萄糖40 g，去皮土豆400 g，加蒸馏水至2 000 mL，pH 6.5。大米固体培养基：100 mL蒸馏水，80 g大米。
1.1.3
试验菌株。该试验所用菌种为环链棒束孢（Isaria cateniannulata），购自安徽农业大学，保存于河北大学药物化学与分子诊断重点实验室菌种库。
1.1.4
供试肿瘤细胞株。人肝癌细胞（Huh-7）、人宫颈癌细胞（Hela）、人胃癌细胞（MGC-803）、人乳腺癌细胞（MCF-7）以及人肺癌细胞（A549）在-196 ℃液氮中冻存。
1.2试验方法
1.2.1
发酵与分离。将Isaria cateniannulata菌种接种到PDA液体培养基中，于26 ℃、150 r/min恒温摇床中培养6 d，得到3 L种子液。将3 L种子液以10%的接种量接种到大米培养基中（共30 L），室温培养30 d，得到固体发酵物。
将Isaria cateniannulata的大米发酵物收集，以1.5倍的体积加入乙酸乙酯萃取，每次浸泡48 h，共萃取6次，合并萃取液，减压浓缩得到浸膏107 g。将107 g浸膏与等体积硅胶拌匀，室温下干燥。进行加压柱层析，用石油醚/乙酸乙酯系统梯度洗脱[100∶0、20∶1、15∶1、10∶1、8∶1、6∶1、4∶1、2∶1、1∶1（V/V）]，经TCL检测之后合并，得到Fr1～Fr5共5个部分。经反复硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶过滤、薄层TLC制备以及重结晶后得到化合物1～8。
1.2.2
活性筛选。将5个细胞株取出，置于37 ℃水浴锅复苏，待其解冻后吸出细胞悬液分别放入4个培养瓶中，加入细胞培养液。置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养。传代培养3次，每3 d传代一次，使细胞恢复健康状态。胰酶消化细胞：用3 mL PBS清洗一次细胞，然后加入1 mL胰酶，37 ℃孵育1～3 min，终止消化。在96孔板中每孔接种100 μL，其含有8 000个细胞。第2天，观察细胞密度，待细胞培养至汇合率80%左右，加药处理。分别将化合物7、8母液进行梯度式稀释，每孔加入2 μL各浓度样品稀释液，使其作用浓度分别为100.00、50.00、25.00、12.50、6.25 μL，每组设3个平行，同时设置阴性对照。样品处理细胞24 h，避光每孔均加入20 μL MTT溶液。37 ℃培养箱中孵育4 h，然后每孔加入100 μL SDS-HCl，孵育过夜。在酶标仪SpectraMax M2上测试各孔570 nm的吸光度值。
抑制率=[（对照组OD570-样品处理组OD570）/对照组OD570]×100%，根据寇式改良公式计算各个样品相应细胞株的IC50，即死亡细胞数与总细胞之比为50%时所对应的样品浓度。 2结果与分析
2.1结构鉴定该试验通过对Isaria cateniannulata进行大米发酵培养，从其乙酸乙酯的萃取物中共分离到8个化合物，分别为化合物1（62.7 mg）、化合物2（22.7 mg）、化合物3（11.2 mg）、化合物4（9.7 mg）、化合物5（13.3 mg）、化合物6（21.5 mg）、化合物7（11.4 mg）、化合物8（2.2 mg）。化合物的结构见图1。
2.2活性测试结果
对从虫生真菌中分离得到的化合物7、8利用MTT法进行抗肿瘤活性测试。测试细胞分别为人胃癌细胞（MGC-803）、人乳腺癌细胞（MCF-7）、人肝癌细胞（Huh-7）、人宫颈癌细胞（Hela）和人肺癌细胞（A549），试验结果如表1。从表1可以看出，化合物7对A549的半抑制浓度值（IC50）为80.44 μg/mL，表明化合物7对A549有一定的抑制作用;化合物8对MGC-803、MCF-7、Huh-7和Hela的IC50值分别为54.88、84.21、61.94、72.99 μg/mL，表明化合物8对Huh-7、Hela、MGC-803和MCF-7具有一定的抑制能力，但抑制能力较弱。
3结论
该研究对虫生真菌环链棒束孢Isaria cateniannulata的次级代谢产物进行分离鉴定，共分离鉴定出8种化合物，分别为β-麦角甾醇、豆甾-4-烯-3-酮、5α，8β-过氧-（22E，24R）-麦角甾-6，22-二烯3β-醇、4-methyl-5，6-dihydro-2H-pyran-2-one、（R）-甲羟戊酸内酯、对羟基苯甲醛、β-石竹烯和石竹烯氧化物，其中8种化合物均为首次从该种中分离得到。对化合物7、8进行抗肿瘤活性测试，结果顯示，化合物7对A549具有一定的抑制能力，化合物8对Huh-7、Hela、MGC-803和MCF-7具有一定的抑制能力，但是抑制能力均较弱。
安徽农业科学2019年
参考文献
[1] 张德龙，王小董，陆瑞利，等.液体或固体培养对环链棒束孢（Isaria cateinannulata）菌丝体中挥发性成分组成的影响[J].微生物学报，2011，51（12）：1616-1624.
[2] 朱新燕，李增智，樊美珍，等.3株环链拟青霉固体培养条件的研究[J].安徽农业大学学报，2008，35（1）：38-41.
[3] 刘爱英，陈月碧，梁宗琦，等.环链拟青霉和玫烟色拟青霉对菜青虫致病条件的研究[J].贵州农业科学，1982（1）：57-59.
[4] 万辉.褐圆孔牛肝菌化学成分的研究[J].中草药，2000，31（5）：328-330.
[5] 李小军，袁燕，李芝，等.苗药冠盖藤的化学成分研究[J].中草药，2014，45（8）：1052-1055.
[6] 和东阳，王利勤.神黄豆果实化学成分的研究[J].中国现代应用药学，2014，31（11）：1355-1359.
[7] YING Y M，ZHANG L W，SHAN W G，et al.Secondary metabolites of Peyronellaea sp.XW-12，an endophytic fungus of Huperzia serrata[J].Chem Nat Compd，2014，50（4）：723-725.
[8] 胡琳，丁智慧，刘吉开.灰黑拟牛肝菌的化学成分[J].云南植物研究，2002，24（5）：667-670.
[9] RAGASA C Y，ESPINEI D L，AGOO E M G，et al.Chemical constituents of Cinnamomum cebuense[J].Chin J Nat Med，2013，11（3）：264-268.
[10] RAGASA C Y，GANZON J，HOFILEA J，et al.A new furanoid diterpene from Caesalpinia pulcherrima[J].Chem Pharm Bull，2003，51（10）：1208-1210.