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【摘 要】国家标准GB/T5511—2008规定，谷物和豆类中粗蛋白质含量测定方法为凯氏定氮法。该方法适用范围广泛，测定结果准确，重现性好，但因其称样量大，消化时间长，蒸馏前需要定容稀释，操作复杂费时，试剂消耗大，给测定带来一定麻烦甚至是误差。就如何缩短消化时间，方便、快捷、准确地获得最佳测定结果，本人在称样量、所加试剂的浓度以及吸收液的酸碱度方面进行了大胆的尝试与探析。
【关键词】谷物和豆类中粗蛋白质；测定方法
1.方法原理
蛋白质是含氮的有机化合物，样品与硫酸和硫酸铜、硫酸钾一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，以硫酸或盐酸标准滴定液滴定，根据酸的消耗量乘以蛋白质换算系数，即为蛋白质含量。
2.试剂与仪器
2.1浓硫酸混合液
在100ml水中缓慢加入浓硫酸200ml，冷却后加入30%过氧化氢300ml，混合均匀。
2.2混合催化剂
硫酸铜10g，硫酸钾100g，硒粉0.2g，在研钵中研细过孔径0.45mm（40目筛），混匀备用。
2.3混合指示剂
2份甲基红乙醇溶液（称取0.1g甲基红置于研钵中加入少许95%乙醇，研磨溶解后，加入75ml95%乙醇）与1份次甲基蓝乙醇溶液（0.1g次甲基蓝溶于80ml95%乙醇中）临用时混合。
2.4 20g/l硼酸溶液
称取20g硼酸溶于1000ml水中。
2.5饱和氢氧化钠溶液
2.6 0.01mol/l盐酸标准溶液
2.7仪器
凯氏定氮蒸馏装置。
3.操作步骤
3.1消化
称取0.050g左右（全部通过40目筛的）固体试样，移入50ml或100ml定氮瓶中，加入1g混合催化剂，再加入3ml浓硫酸混合液，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，以45度角斜支于有石棉网的电炉上。小火加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止，烟雾变白后，加强火力，保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热10min，取下放冷备用。同时做试剂空白试验。
3.2蒸馏
连接好定氮蒸馏装置，于水蒸气发生瓶内装水至2/3处，加数粒玻璃珠，加甲基红次甲基蓝指示液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水至沸腾，反应室清洗干净后，即放缓加热至反应室内的残液不倒吸为宜，向接收瓶内加入10ml硼酸溶液及1-2滴混合指示液，并使冷凝管下端插入吸收瓶液面下，将定氮瓶中消化液用蒸馏水少量多次冲冼，使之全部干净地转移至反应室中，清洗进样口管路，塞紧棒状玻塞，加水封严。加热，待反应室内有热气进入，立即打开碱液管活塞加入饱和氢氧化钠至溶液呈现深褐色，停止加入，拧紧活塞，开始蒸馏。待吸收瓶中溶液出现绿色记时5min，到时后将接收瓶放低，继续蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管下部。
3.3滴定
取下接收瓶，以硫酸或盐酸标准滴定液滴定至淡紫色（灰红色）为终点，同时做试剂空白试验。
3.4计算
试样中蛋白质含量按下式计算：
X=（V1-V0）×C×0.0140×F×100/m×（1-M）
式中： X——试样中蛋白质含量，单位为g/100g或g/100ml；
V1、V0——试样、空白液消耗标准滴定液的体积，单位为ml；
C——硫酸或盐酸标准滴定液浓度，单位为mol/L；
0.0140——1.0ml硫酸或盐酸标准滴定液相当的氮的质量，
单位为克；
m——试样质量或体积，单位为克或毫升；
F——氮换算为蛋白质的系数；
M——试样水分%
4.试验方法探析
（1）称取的试样量由标准中规定的0.2-0.3g改为0.050g左右，可将消化时间由原来的2-3h缩短为40min，由于样品量减少还可免去消化液稀释定容带来的麻烦与误差。
不同称样量测试结果比对
不同称样量空白加标回收率测试比对
上述测试结果表明，对粗蛋白质含量较高的样品减小称样量，无论对结果的准确性还是重现性都无任何影响。这样既节省时间，提高工作效率，又降低了实验成本，降低了对环境的污染。
（2）氢氧化钠由400g/l改为饱和溶液。因为在蒸馏过程中，消化液中的硫酸铵若没有足够的碱来中和，很难使氨彻底分离出来，甚至导致整个测定失败。氢氧化钠在本方法中的作用有两个方面，一是中和样品消化液中剩余的酸，二是为氨的有效分离提供一个碱性环境。所以我们在尽量不增加反应室内液体体积的前提下，采取加入饱和氢氧化钠来保证氨的有效分离，彻底放出，得到可靠、准确的测定结果。（下转第184页）
（上接第75页）（3）将20g/l的硼酸吸收液PH值调整为5.4左右。因甲基红和次甲基蓝混合指示剂的PH变色范围为5.4，只有当酸碱反应的等当点，落在指示剂PH值变色点范围内，所得的测定结果才愈准确，多次实践证明也只有当硼酸的PH值在5.4左右时，空白值才能出现正常，既消耗标液体积在0.2-0.4ml，同时空白加标回收率才能达到理想的效果，否则，将出现空白值为零，空白加标回收率偏高或偏低现象，测定结果准确性差。
5.注解与注意事项
（1）称量好的样品要用长条状蜡光纸一次送入凯氏烧瓶底部，切勿沾附瓶颈部，如有少量沾附可用少量蒸馏水冲入底部。
（2）消化时，要在通风橱中进行，采用长颈园底凯氏烧瓶以45度角斜支于电炉上，瓶口置一小漏斗，增加酸液回流，加速消化。
（3）消化过程中，样品中有机质如淀粉分解转化为糖类，高温下变黑，并产生泡沫，这时要先小火，勿使黑色物质上升到凯氏烧瓶颈部，待消化液泡沫消失，均匀沸腾后，再加大火力，直至消化液黄色完全消失呈淡蓝色透明为止。
（4）消化时应注意旋转凯氏烧瓶，将附在瓶壁上的碳粒冲下，使之彻底消化。若样品不易消化至澄清透明，可将凯氏烧瓶中溶液冷却，加入数滴过氧化氢后，再继续加热消化至完全。
（5）如样品含脂肪较多时，可适当增加硫酸量，因硫酸量少时，过多的硫酸钾会与硫酸生成硫酸氢钾而不与氨作用，导致氨损失，使结果偏低。
（6）蒸馏时，蒸汽发生要均匀、充足，蒸馏中途不得停火断气，否则发生倒吸，加碱时动作要快，防止氨损失，并注意不能使碱液污染冷凝管及接收瓶，如发现碱污染，应立即停止蒸馏，待清洗干净后再蒸馏。
（7）蒸馏前冷凝管出口就要浸入吸收液中，防止氨挥发损失。蒸馏结束后，应先将吸收液离开冷凝管口，以免发生倒吸，再蒸馏1min。
（8）蒸馏过程中硼酸吸收液的温度不应超过40℃，否则氨吸收减弱，造成检测结果偏低。必要时可把接收瓶置于冷水浴中。
（9）蒸馏是否完全，可用精密PH试纸测试冷凝管口的冷凝液加以确定。
（10）当采用甲基红与次甲基蓝混合指示剂时，滴定终点应为淡紫色（灰红色）而且要控制样品与空白终点颜色的一致性。
（11）消化液若不能很快蒸馏，应保存消化液，蒸馏前再加水。
【参考文献】
[1]国家标准《食品卫生检验方法 理化部分（二）》.
[2]辽宁省粮食局编著.粮油质量检验手册.
【关键词】谷物和豆类中粗蛋白质；测定方法
1.方法原理
蛋白质是含氮的有机化合物，样品与硫酸和硫酸铜、硫酸钾一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，以硫酸或盐酸标准滴定液滴定，根据酸的消耗量乘以蛋白质换算系数，即为蛋白质含量。
2.试剂与仪器
2.1浓硫酸混合液
在100ml水中缓慢加入浓硫酸200ml，冷却后加入30%过氧化氢300ml，混合均匀。
2.2混合催化剂
硫酸铜10g，硫酸钾100g，硒粉0.2g，在研钵中研细过孔径0.45mm（40目筛），混匀备用。
2.3混合指示剂
2份甲基红乙醇溶液（称取0.1g甲基红置于研钵中加入少许95%乙醇，研磨溶解后，加入75ml95%乙醇）与1份次甲基蓝乙醇溶液（0.1g次甲基蓝溶于80ml95%乙醇中）临用时混合。
2.4 20g/l硼酸溶液
称取20g硼酸溶于1000ml水中。
2.5饱和氢氧化钠溶液
2.6 0.01mol/l盐酸标准溶液
2.7仪器
凯氏定氮蒸馏装置。
3.操作步骤
3.1消化
称取0.050g左右（全部通过40目筛的）固体试样，移入50ml或100ml定氮瓶中，加入1g混合催化剂，再加入3ml浓硫酸混合液，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，以45度角斜支于有石棉网的电炉上。小火加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止，烟雾变白后，加强火力，保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热10min，取下放冷备用。同时做试剂空白试验。
3.2蒸馏
连接好定氮蒸馏装置，于水蒸气发生瓶内装水至2/3处，加数粒玻璃珠，加甲基红次甲基蓝指示液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水至沸腾，反应室清洗干净后，即放缓加热至反应室内的残液不倒吸为宜，向接收瓶内加入10ml硼酸溶液及1-2滴混合指示液，并使冷凝管下端插入吸收瓶液面下，将定氮瓶中消化液用蒸馏水少量多次冲冼，使之全部干净地转移至反应室中，清洗进样口管路，塞紧棒状玻塞，加水封严。加热，待反应室内有热气进入，立即打开碱液管活塞加入饱和氢氧化钠至溶液呈现深褐色，停止加入，拧紧活塞，开始蒸馏。待吸收瓶中溶液出现绿色记时5min，到时后将接收瓶放低，继续蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管下部。
3.3滴定
取下接收瓶，以硫酸或盐酸标准滴定液滴定至淡紫色（灰红色）为终点，同时做试剂空白试验。
3.4计算
试样中蛋白质含量按下式计算：
X=（V1-V0）×C×0.0140×F×100/m×（1-M）
式中： X——试样中蛋白质含量，单位为g/100g或g/100ml；
V1、V0——试样、空白液消耗标准滴定液的体积，单位为ml；
C——硫酸或盐酸标准滴定液浓度，单位为mol/L；
0.0140——1.0ml硫酸或盐酸标准滴定液相当的氮的质量，
单位为克；
m——试样质量或体积，单位为克或毫升；
F——氮换算为蛋白质的系数；
M——试样水分%
4.试验方法探析
（1）称取的试样量由标准中规定的0.2-0.3g改为0.050g左右，可将消化时间由原来的2-3h缩短为40min，由于样品量减少还可免去消化液稀释定容带来的麻烦与误差。
不同称样量测试结果比对
不同称样量空白加标回收率测试比对
上述测试结果表明，对粗蛋白质含量较高的样品减小称样量，无论对结果的准确性还是重现性都无任何影响。这样既节省时间，提高工作效率，又降低了实验成本，降低了对环境的污染。
（2）氢氧化钠由400g/l改为饱和溶液。因为在蒸馏过程中，消化液中的硫酸铵若没有足够的碱来中和，很难使氨彻底分离出来，甚至导致整个测定失败。氢氧化钠在本方法中的作用有两个方面，一是中和样品消化液中剩余的酸，二是为氨的有效分离提供一个碱性环境。所以我们在尽量不增加反应室内液体体积的前提下，采取加入饱和氢氧化钠来保证氨的有效分离，彻底放出，得到可靠、准确的测定结果。（下转第184页）
（上接第75页）（3）将20g/l的硼酸吸收液PH值调整为5.4左右。因甲基红和次甲基蓝混合指示剂的PH变色范围为5.4，只有当酸碱反应的等当点，落在指示剂PH值变色点范围内，所得的测定结果才愈准确，多次实践证明也只有当硼酸的PH值在5.4左右时，空白值才能出现正常，既消耗标液体积在0.2-0.4ml，同时空白加标回收率才能达到理想的效果，否则，将出现空白值为零，空白加标回收率偏高或偏低现象，测定结果准确性差。
5.注解与注意事项
（1）称量好的样品要用长条状蜡光纸一次送入凯氏烧瓶底部，切勿沾附瓶颈部，如有少量沾附可用少量蒸馏水冲入底部。
（2）消化时，要在通风橱中进行，采用长颈园底凯氏烧瓶以45度角斜支于电炉上，瓶口置一小漏斗，增加酸液回流，加速消化。
（3）消化过程中，样品中有机质如淀粉分解转化为糖类，高温下变黑，并产生泡沫，这时要先小火，勿使黑色物质上升到凯氏烧瓶颈部，待消化液泡沫消失，均匀沸腾后，再加大火力，直至消化液黄色完全消失呈淡蓝色透明为止。
（4）消化时应注意旋转凯氏烧瓶，将附在瓶壁上的碳粒冲下，使之彻底消化。若样品不易消化至澄清透明，可将凯氏烧瓶中溶液冷却，加入数滴过氧化氢后，再继续加热消化至完全。
（5）如样品含脂肪较多时，可适当增加硫酸量，因硫酸量少时，过多的硫酸钾会与硫酸生成硫酸氢钾而不与氨作用，导致氨损失，使结果偏低。
（6）蒸馏时，蒸汽发生要均匀、充足，蒸馏中途不得停火断气，否则发生倒吸，加碱时动作要快，防止氨损失，并注意不能使碱液污染冷凝管及接收瓶，如发现碱污染，应立即停止蒸馏，待清洗干净后再蒸馏。
（7）蒸馏前冷凝管出口就要浸入吸收液中，防止氨挥发损失。蒸馏结束后，应先将吸收液离开冷凝管口，以免发生倒吸，再蒸馏1min。
（8）蒸馏过程中硼酸吸收液的温度不应超过40℃，否则氨吸收减弱，造成检测结果偏低。必要时可把接收瓶置于冷水浴中。
（9）蒸馏是否完全，可用精密PH试纸测试冷凝管口的冷凝液加以确定。
（10）当采用甲基红与次甲基蓝混合指示剂时，滴定终点应为淡紫色（灰红色）而且要控制样品与空白终点颜色的一致性。
（11）消化液若不能很快蒸馏，应保存消化液，蒸馏前再加水。
【参考文献】
[1]国家标准《食品卫生检验方法 理化部分（二）》.
[2]辽宁省粮食局编著.粮油质量检验手册.