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摘要：目的 采用超高效液相色谱与串联四级杆飞行时间质谱仪联用技术（UPLC-Q-TOF-MS/MS）分析鉴定大鼠灌胃马钱苷后其在尿液中的代谢产物，阐明马钱苷代谢途径。方法 大鼠灌胃给予马钱苷，收集给药前后的尿样，经固相萃取进行预处理，采用超高液相色谱C18色谱柱，流动相为乙腈-1%甲酸水，梯度洗脱，采用动态背景扣除（DBS）触发信息关联采集（IDA）进行MS/MS数据采集。结果 经MetabolitePilot代谢物分析软件处理后，根据MS/MS给出质谱碎片信息对代谢产物进行结构推测，共鉴定马钱苷代谢物3种，并归纳了马钱苷在大鼠体内的代谢过程。结论 该方法简单可靠，灵敏度高，可用于体内微量成分的分析鉴定。
关键词：超高效液相色谱与串联四级杆飞行时间质谱仪联用技术；马钱苷；代谢产物
Abstract：Objective To identify the metabolites of loganin in rat urine through using ultra high performance liquid chromatography combined with triple TOF mass spectrometry （UPLC-Q-TOF/ MS/MS） after oral administration of loganin；To summarize the metabolic pathway of loganin. Methods Rats were given a gavage with loganin. The urine samples were prepared by use of solid phase extraction （SPE）. The chromatographic separation was performed on an UPLC C18 column with gradient elution program of acetonitrile and 0.1% formic acid aqueous as mobile phase. Dynamic background subtraction （DBS） technology was employed to trigger information dependent acquisition （IDA） to obtain the characteristic fragment ions of metabolites. Results MetabolitePilot software including several data processing methods were employed to speculate the structures of liganin metabolites and three metabolites were identified. Then， the metabolic pathway of loganin in rats was summarized. Conclusion The analytical method was simple， credible and highly- sensible， which is useful for screening and identifying trace constituents in vivo.
Key words：UPLC-Q-TOF-MS/MS；loganin；metabolites
马钱苷（Loganin）为山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc.的有效成分[1]，具有抗心律失常[2]、抗休克[3]、强心[4]的功效，对免疫系统有双向调节作用[5]。近年来，山茱萸的药代动力学研究已有报道[6-7]，而马钱苷的代谢研究报道鲜见。高分辨质谱以其高灵敏度和高分辨率等特点成为复杂生物体系中化学成分分离和鉴定的有力工具[8-9]。本研究应用超高效液相色谱与串联四级杆飞行时间质谱仪联用技术（UPLC-Q-TOF-MS/MS）对大鼠灌胃马钱苷后的体内代谢产物进行分离鉴定，根据质谱裂解规律，推测代谢物的化学结构，总结代谢途径，为马钱苷的临床应用提供参考。
1 仪器、试药与动物
超高效液相色谱系统（Agilent 1200 Infinity Series，Agilent Technologies，USA），质谱仪（AB SCEIX Triple-TOFTM 5600+ System，AB SCIEX，USA）；数据采集软件：Analyst?RTF 1.6 software（AB SCEIX， USA）；数据处理软件系统：MetabolitePilot 1.5（AB SCEIX， USA）；超高效液相柱Phenomenex Kinetex C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；分析天平（AG-135，瑞士Mettler Toledo公司）；高速离心机（GT16-3，北京时代北利离心机有限公司），混合器（ZH-2型，天津药典标准仪器厂）；固相萃取小柱（Waters Sep-Pak? Vac 3cc 200 mg C18）。
马钱苷对照品（批号111640-201005），购自中国食品药品检定研究院；乙腈（色谱纯，Fisher，USA），甲酸（色谱纯，Diamond，USA），甲醇（分析纯，天津科密欧试剂公司），水为重蒸馏水。
雄性SD大鼠，6只，体质量250～300 g，中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所提供，许可证编号SCXK（京）2009-0017，合格证编号0252886。
2 方法
2.1 对照品溶液的制备 精密称取马钱苷对照品适量，用甲醇溶解，制备对照品储备溶液。再用0.1%甲酸-甲醇（1∶1）的混合溶液稀释为20 ng/mL的溶液，用于质谱分析。
2.2 分组与给药
将大鼠随机分为空白组和给药组，每组3只。6只大鼠分别饲养于不同的代谢笼中，自由饮水，温度（22±2）℃，湿度55%±5%，每日光照12 h。于给药前12 h禁食。给药组灌胃给予0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）配制成浓度为1 mg/mL的马钱苷溶液，给药剂量为15 mg/kg。空白组灌胃等体积0.5%CMC-Na溶液。分别收集0～48 h的尿液，-40 ℃保存。
2.3 生物样品预处理
分别将大鼠尿样加在不同的固相萃取小柱上（用5 mL甲醇和5 mL水预洗），先用水2 mL洗涤，再用甲醇2 mL洗脱，收集甲醇洗脱液，合并，40 ℃氮气流吹干，残渣再用1 mL甲醇溶解，12 000 r/min离心10 min，精密吸取上清液3 μL，进行UPLC-MS检测。
2.4 液相色谱条件
色谱柱：Phenomenex Kinetex C18（100 mm×2.1 mm， 2.6 μm）；柱温：50 ℃，流速：0.4 mL/min；流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～2 min， 5%B；2～12 min，5%→20%B；12～13 min，20%→100%B）；每次进样前平衡2 min；进样体积：3 μL。
2.5 质谱条件
离子源为电喷雾离子化源（ESI），源喷射电压（IS）为5500 V，正离子检测模式；雾化温度：550 ℃，解簇电压（DP）：60 V；碰撞能量（CE）：45 eV。雾化气（Gas1，N2）为55 psi；辅助气（Gas2，N2）为55 psi，气帘气（Cur，N2）为35 psi；一级全扫描范围100～600 amu，累积时间200 ms。信息关联采集（IDA）参数：永远不排除监测相同质荷比的离子，开启动态背景扣除（DBS），且对每一个时间8个响应值超过100 cps的峰进行子离子扫描，子离子扫描范围：50～600 amu，累积时间70 ms。碰撞能量扩展（CES）：15 eV。试验过程采用自动校准（CDS）。
3 结果
3.1 马钱苷及其代谢产物鉴定
采用MetabolitePilot 1.5代谢物分析软件，根据TOF-MS检测的准确分子质量、质谱碎片信息、元素组成等对马钱苷可能存在的代谢进行分析，共鉴定代谢产物3种，提取离子图见图1。
4 小结
试验过程中比较了正负离子下母药马钱苷的质谱裂解信息，正离子响应明显高于负离子，且具有丰富的质谱碎片信息，更有利于质谱解析。与空白组尿样比较，给药组尿样出现新的色谱峰，还发现了新的代谢产物，但由于碎片信息量缺乏，无法进行推测，还有待于进一步研究。
参考文献：
[1] 李雅梅，李华，李春荣.山茱萸化学成分及其药理作用研究进展[J].武警医学院学报，2010，19（6）：500-502.
[2] 阎润红，任晋斌，刘必旺，等.山茱萸抗心律失常作用的实验研究[J].山西中医，2001，17（5）：52-55.
[3] 王天山，潘扬，殷飞，等.马钱素与辛弗林对家兔重症失血性休克模型的作用[J].南京中医药大学学报，1999，15（6）：345-346.
[4] 阎润红，任晋斌，倪艳，等.山茱萸强心作用的实验观察[J].山西中医学院学报，2000，1（2）：1-3.
[5] 贾德贤，闫兴丽，张建军，等.山茱萸化学及药理研究进展[J].中国中医药信息杂志，2002，9（7）：83-85.
[6] 李小娜.山茱萸有效成分的提取分离与药代动力学研究[D].石家庄：河北医科大学，2007.
[7] Gang Cao， Hao Cai， Yun Zhang， et al. Identification of metabolites of crude and processed Fructus Corni in rats by microdialysis sampling coupled with electrospray ionization linear quadrupoleion trap mass spectrometry[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2011，56：118-125.
[8] Yuxin Wang， Haiping Hao， Guangji Wang， et al. An approach to identifying sequential metabolites of a typical phenylethanoid glycoside， echinacoside， based on liquid chromatography–ion trap-time of flight mass spectrometry analysis[J]. Talanta，2009， 80：572-580.
[9] Bhagwat Prasad， Saranjit Singh. Identification of rat urinary metabolites of rifabutin using LC–MS nand LC–HR-MS[J]. European Journal of Pharmaceutical Sciences，2010，41：173-188.
（收稿日期：2014-02-17；编辑：陈静）
关键词：超高效液相色谱与串联四级杆飞行时间质谱仪联用技术；马钱苷；代谢产物
Abstract：Objective To identify the metabolites of loganin in rat urine through using ultra high performance liquid chromatography combined with triple TOF mass spectrometry （UPLC-Q-TOF/ MS/MS） after oral administration of loganin；To summarize the metabolic pathway of loganin. Methods Rats were given a gavage with loganin. The urine samples were prepared by use of solid phase extraction （SPE）. The chromatographic separation was performed on an UPLC C18 column with gradient elution program of acetonitrile and 0.1% formic acid aqueous as mobile phase. Dynamic background subtraction （DBS） technology was employed to trigger information dependent acquisition （IDA） to obtain the characteristic fragment ions of metabolites. Results MetabolitePilot software including several data processing methods were employed to speculate the structures of liganin metabolites and three metabolites were identified. Then， the metabolic pathway of loganin in rats was summarized. Conclusion The analytical method was simple， credible and highly- sensible， which is useful for screening and identifying trace constituents in vivo.
Key words：UPLC-Q-TOF-MS/MS；loganin；metabolites
马钱苷（Loganin）为山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc.的有效成分[1]，具有抗心律失常[2]、抗休克[3]、强心[4]的功效，对免疫系统有双向调节作用[5]。近年来，山茱萸的药代动力学研究已有报道[6-7]，而马钱苷的代谢研究报道鲜见。高分辨质谱以其高灵敏度和高分辨率等特点成为复杂生物体系中化学成分分离和鉴定的有力工具[8-9]。本研究应用超高效液相色谱与串联四级杆飞行时间质谱仪联用技术（UPLC-Q-TOF-MS/MS）对大鼠灌胃马钱苷后的体内代谢产物进行分离鉴定，根据质谱裂解规律，推测代谢物的化学结构，总结代谢途径，为马钱苷的临床应用提供参考。
1 仪器、试药与动物
超高效液相色谱系统（Agilent 1200 Infinity Series，Agilent Technologies，USA），质谱仪（AB SCEIX Triple-TOFTM 5600+ System，AB SCIEX，USA）；数据采集软件：Analyst?RTF 1.6 software（AB SCEIX， USA）；数据处理软件系统：MetabolitePilot 1.5（AB SCEIX， USA）；超高效液相柱Phenomenex Kinetex C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；分析天平（AG-135，瑞士Mettler Toledo公司）；高速离心机（GT16-3，北京时代北利离心机有限公司），混合器（ZH-2型，天津药典标准仪器厂）；固相萃取小柱（Waters Sep-Pak? Vac 3cc 200 mg C18）。
马钱苷对照品（批号111640-201005），购自中国食品药品检定研究院；乙腈（色谱纯，Fisher，USA），甲酸（色谱纯，Diamond，USA），甲醇（分析纯，天津科密欧试剂公司），水为重蒸馏水。
雄性SD大鼠，6只，体质量250～300 g，中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所提供，许可证编号SCXK（京）2009-0017，合格证编号0252886。
2 方法
2.1 对照品溶液的制备 精密称取马钱苷对照品适量，用甲醇溶解，制备对照品储备溶液。再用0.1%甲酸-甲醇（1∶1）的混合溶液稀释为20 ng/mL的溶液，用于质谱分析。
2.2 分组与给药
将大鼠随机分为空白组和给药组，每组3只。6只大鼠分别饲养于不同的代谢笼中，自由饮水，温度（22±2）℃，湿度55%±5%，每日光照12 h。于给药前12 h禁食。给药组灌胃给予0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）配制成浓度为1 mg/mL的马钱苷溶液，给药剂量为15 mg/kg。空白组灌胃等体积0.5%CMC-Na溶液。分别收集0～48 h的尿液，-40 ℃保存。
2.3 生物样品预处理
分别将大鼠尿样加在不同的固相萃取小柱上（用5 mL甲醇和5 mL水预洗），先用水2 mL洗涤，再用甲醇2 mL洗脱，收集甲醇洗脱液，合并，40 ℃氮气流吹干，残渣再用1 mL甲醇溶解，12 000 r/min离心10 min，精密吸取上清液3 μL，进行UPLC-MS检测。
2.4 液相色谱条件
色谱柱：Phenomenex Kinetex C18（100 mm×2.1 mm， 2.6 μm）；柱温：50 ℃，流速：0.4 mL/min；流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～2 min， 5%B；2～12 min，5%→20%B；12～13 min，20%→100%B）；每次进样前平衡2 min；进样体积：3 μL。
2.5 质谱条件
离子源为电喷雾离子化源（ESI），源喷射电压（IS）为5500 V，正离子检测模式；雾化温度：550 ℃，解簇电压（DP）：60 V；碰撞能量（CE）：45 eV。雾化气（Gas1，N2）为55 psi；辅助气（Gas2，N2）为55 psi，气帘气（Cur，N2）为35 psi；一级全扫描范围100～600 amu，累积时间200 ms。信息关联采集（IDA）参数：永远不排除监测相同质荷比的离子，开启动态背景扣除（DBS），且对每一个时间8个响应值超过100 cps的峰进行子离子扫描，子离子扫描范围：50～600 amu，累积时间70 ms。碰撞能量扩展（CES）：15 eV。试验过程采用自动校准（CDS）。
3 结果
3.1 马钱苷及其代谢产物鉴定
采用MetabolitePilot 1.5代谢物分析软件，根据TOF-MS检测的准确分子质量、质谱碎片信息、元素组成等对马钱苷可能存在的代谢进行分析，共鉴定代谢产物3种，提取离子图见图1。
4 小结
试验过程中比较了正负离子下母药马钱苷的质谱裂解信息，正离子响应明显高于负离子，且具有丰富的质谱碎片信息，更有利于质谱解析。与空白组尿样比较，给药组尿样出现新的色谱峰，还发现了新的代谢产物，但由于碎片信息量缺乏，无法进行推测，还有待于进一步研究。
参考文献：
[1] 李雅梅，李华，李春荣.山茱萸化学成分及其药理作用研究进展[J].武警医学院学报，2010，19（6）：500-502.
[2] 阎润红，任晋斌，刘必旺，等.山茱萸抗心律失常作用的实验研究[J].山西中医，2001，17（5）：52-55.
[3] 王天山，潘扬，殷飞，等.马钱素与辛弗林对家兔重症失血性休克模型的作用[J].南京中医药大学学报，1999，15（6）：345-346.
[4] 阎润红，任晋斌，倪艳，等.山茱萸强心作用的实验观察[J].山西中医学院学报，2000，1（2）：1-3.
[5] 贾德贤，闫兴丽，张建军，等.山茱萸化学及药理研究进展[J].中国中医药信息杂志，2002，9（7）：83-85.
[6] 李小娜.山茱萸有效成分的提取分离与药代动力学研究[D].石家庄：河北医科大学，2007.
[7] Gang Cao， Hao Cai， Yun Zhang， et al. Identification of metabolites of crude and processed Fructus Corni in rats by microdialysis sampling coupled with electrospray ionization linear quadrupoleion trap mass spectrometry[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2011，56：118-125.
[8] Yuxin Wang， Haiping Hao， Guangji Wang， et al. An approach to identifying sequential metabolites of a typical phenylethanoid glycoside， echinacoside， based on liquid chromatography–ion trap-time of flight mass spectrometry analysis[J]. Talanta，2009， 80：572-580.
[9] Bhagwat Prasad， Saranjit Singh. Identification of rat urinary metabolites of rifabutin using LC–MS nand LC–HR-MS[J]. European Journal of Pharmaceutical Sciences，2010，41：173-188.
（收稿日期：2014-02-17；编辑：陈静）