【摘 要】
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应用PCR技术从p EGFP-N1载体扩增获取CMV启动子和EGFP基因,利用限制性内切酶BglⅡ/NotⅠ以及NotⅠ/Eco RⅠ将其插入p T/HB,构成p T-CMV-EGFP重组转座子,p T-CMV-EGFP与SB11转
【机 构】
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昆明医科大学附属甘美医院生物医学实验中心;
【基金项目】
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云南省应用基础研究昆医联合专项(2013FZ290)
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应用PCR技术从p EGFP-N1载体扩增获取CMV启动子和EGFP基因,利用限制性内切酶BglⅡ/NotⅠ以及NotⅠ/Eco RⅠ将其插入p T/HB,构成p T-CMV-EGFP重组转座子,p T-CMV-EGFP与SB11转座酶形成"睡美人"转座系统.采用脂质体与荧光表达载体p EGFP-N1不同配比转染小鼠成纤维细胞系3T3,p TCMV-EGFP与SB11梯度比例转染小鼠肝癌细胞系H22后,经流式细胞术比较阳性细胞率,当条件为脂质体与总DNA质量比为4∶1;转座酶与转座子间质量比为1∶4转染时,细胞阳性率最高(H22悬浮细胞可达42.23%),转染结果较稳定(SD=1.25).通过此优化体系转染小鼠骨髓来源的树突状细胞DCs,经激光共聚焦显微镜显示,能够获得被EGFP修饰的DCs,并通过流式细胞术检测被标记有EGFP的特异DCs阳性率可达20%以上.表明本研究已成功建立了一个可用于原代DCs转染的方法.
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