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摘要
昆虫是变温动物，为了安全越冬，昆虫通常改变自身结构和物质构成以适应低温的到来，这一适应机制与体内特殊的生理生化物质紧密相关，如海藻糖、葡萄糖、甘油、山梨醇、脂肪酸和氨基酸等小分子抗冻保护剂。这些抗冻保护剂具有稳定细胞膜结构和保护蛋白质功能的作用。虽然昆虫耐寒性的研究不断深入，但目前我们仍然很难确定影响耐寒的关键因素是什么？为什么有些昆虫在低于-20℃环境下还能存活？为了弄清这一科学问题，科学家们利用转录组、基因组、蛋白质组和代谢组等各种组学剖析低温胁迫后昆虫生理反应的分子机制。本文旨在综述前人对昆虫耐寒性的研究，为将来其他昆虫或动植物的耐寒性研究提供参考依据。同时，也为新型生物农药的开发和天敌昆虫的人工助增提供广阔思路。
关键词
昆虫；耐寒性；抗冻保护剂；机制
中图分类号：
Q 965
文献标识码：A
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2016.06.003
Abstract
As ectothermic animals， insects usually convert its structure and physiological material composition in order to survive safely in winter. This adaptation mechanism is closely related to the special physiological and biochemical substances in the body， such as trehalose， dextrose， glycerol， sorbitol， fatty acids， amino acids and other frost protection agents of small molecules. These antifreeze agents have the function of stabilizing the cell membrane structure and protecting the protein function. Currently， research on the cold tolerance of insects is deepening， but it is still difficult to determine the key factors that affect the cold tolerance. Why some insects can survive below -20℃？ In order to clarify the scientific issues， a large number of scholars have used the theory of transcriptomics， genomics， proteomics and metabolomics to analyze the molecular mechanisms of insect physiological responses after low temperature stress. The purpose of this article is to review the cold tolerance aspects of previous studies and provide a reference for future studies of other insects or cold flora and fauna. At the same time， it also provides a broad way for the development of new biopesticides and increasing natural enemies of insects artificially.
Key words
insect；cold tolerance；frost protection agent；mechanism
昆虫耐寒性研究最早起源于18世纪30年代，Bachmetjew发现了昆虫的过冷却点[1]。直到20世纪60年代，Salt[2] 应用简单的仪器设备进行了昆虫耐低温的生理试验。随着科学技术的发展，许多高科技的手段被用于揭示低温生物学问题，比如：气相色谱、液相色谱、电泳法、差示扫描量热法、核磁共振光谱和各种组学，包括转录组、基因组、基因芯片、蛋白质组和代谢组等。
影响昆虫耐寒的因素主要包括生物因素和非生物因素。生物因素主要包括寄主营养、发育历期及雌雄差异等；非生物因素主要有季节性气温变化、快速冷驯化、环境湿度、光周期及不同地理位置等。昆虫耐寒是各种因素相互作用的结果[3]，并非单一的体系，而是由多种抗寒物质组成的复杂系统[46]。昆虫应对低温耐寒的对策主要分为两类：一类是行为对策，即生态适应对策，当冬季低温来临时，昆虫通过行为活动寻找合适的躲避场所，比如迁飞、休眠和滞育等；另一类是生理对策，即改变体内生理生化物质比例，提高耐寒性。目前，昆虫耐寒性研究主要围绕过冷却点、小分子抗冻保护剂、抗冻蛋白和热休克蛋白等方面进行机理解析[7]。然而，不同昆虫耐寒机理不尽相同，本文对前人的大量研究进行了综述。
1昆虫耐低温的生理生化机制
昆虫是变温动物，能否安全越冬直接关系到昆虫下一年种群的繁衍。19世纪60年代，人们开始意识到昆虫的耐寒性与昆虫自身生理调节紧密相关。
1.1过冷却点的降低
温度低于昆虫体液冰点而不凝固的现象称作过冷却现象。过冷却点是描述昆虫耐寒性的主要指标之一。昆虫的过冷却点在不同个体和群体之间差异很大，受环境、自身发育、机体代谢等多种因素影响，因此，这些因素也影响昆虫的耐寒性。进入过冷却状态是北半球温带和寒温带地区昆虫采取的主要越冬策略。苹淡褐卷蛾（Epiphyas postvittana）幼虫经冷驯化处理后，过冷却点和死亡率均明显降低[8]。美洲芹凤蝶（Papilio zelicaon）越冬蛹过冷却点为-20.5℃时，可以在-30℃幸存，但经春季暖温暴露后，过冷却点升为-17℃，在-20℃仅能存活1 h[9]。由此说明低温冷驯化对降低昆虫过冷却点至关重要，也是自然环境下昆虫能够正常越冬必不可少的步骤。 1.2体内冰核物质的排除与结构调整
生物体中常有异源催化物质，促使水分子重新排列，并在零下温度结冰，这种催化物质被称作冰核促成活性因子（ice nucleating active agents，INA），简称为冰核。早期在细菌的核中得到证实，细胞外膜上的蛋白、碳水化合物和脂类限制了冰核的形成。同样，在昆虫体液中，也存在冰核。除去冰核可以增加昆虫的耐寒性，提高小分子防冻保护剂的合成。食物和细菌在昆虫肠道内被认为是潜在的冰核物质，因此，在低温下可以通过停止取食的方式除去这些潜在的冰核物质。最近，Worland等[1011]在弹尾目昆虫中发现蜕皮可以降低过冷却点，可能由于弹尾目昆虫通过蜕皮脱掉了潜在的冰核物质。近年来通过基因芯片技术证明了蜕皮与过冷却点降低存在一定的联系。另外，冰核结构也是影响过冷却点的因素，不同的冰核结构有助于山楂粉蝶（Aporia crataegi）耐受-85℃低温[12]。因此，说明不同昆虫通过不同的途径处理冰核来达到抵抗低温的目的。
1.3小分子抗冻保护剂的积累
越冬昆虫体内聚集小分子抗冻保护剂，如甘油、多元醇、糖类等，可增加昆虫体内束缚水的含量；直接与酶及其他蛋白相互作用，提高昆虫机体的耐寒性。有研究报道，长角血蜱（Haemaphysalis longicornis）滞育卵中山梨醇和甘油的积累是重要的越冬抗冻保护剂[13]；冰川摇蚊（Pseudodiamesa branickii）体内主要以葡萄糖和蔗糖作为小分子抗冻保护剂[14]；大螟（Sesamia inferens）体内小分子抗冻保护剂，如甘油、海藻糖、果糖、葡萄糖和肌醇含量的变化与季节气温波动完全吻合[15]。因此，说明昆虫抵抗低温并非单一物质行为，而是存在多元抗冻保护系统。
1.4脂类的转化
目前，研究与耐寒相关的脂类主要有软脂酸、亚油酸、脂肪酸酯和油酸等。脂肪是生物体的三大基础物质之一，具有贮能和保温等功能，同时在低温耐寒方面起着非常重要的作用[1618]。昆虫脂肪耐寒主要表现在：其一，脂肪具有贮能、供能的功效，如低温饲养条件下剑川无钩蝠蛾（Hepialus jianchuanensis）幼虫体内脂肪含量明显高于较高温度饲养的个体[19]；其二，脂肪可以减少昆虫体内自由水含量，从而增加其耐寒性[20]；其三，游离脂肪含量影响昆虫过冷却点的变化。作为脂肪代谢产物的甘油可以降低白蜡窄吉丁（Agrilus planipennis）的过冷却点，保护其组织不受低温的伤害[21]。
脂肪酸是脂肪合成的底物，因此，它与昆虫的耐寒性有着紧密的联系。一般情况下，随着温度的降低，不饱和脂肪酸含量升高，饱和脂肪酸含量降低，增加昆虫体内不饱和脂肪酸含量可以阻止细胞膜脂在低温下结晶。Nieminen等[22]的研究表明，颈利虱蝇（Lipoptena cervi）体内不饱和脂肪酸含量在晚秋季节显著高于夏季。
脂肪参与昆虫体内各种代谢反应，直接或间接地影响昆虫的多种生理反应。同时，脂肪含量的变化影响昆虫耐寒性的机制也并非单一，因此，需要进一步从分子层面深入研究。
1.5自由氨基酸的合成
温度胁迫也能触发昆虫体内自由氨基酸的代谢反应。在低温条件下，自由氨基酸对昆虫机体具有抗冻保护的作用。蠋蝽（Arma chinensis）经快速冷驯化处理后，体内自由氨基酸含量发生较大变化，其中丙氨酸和谷氨酸含量明显升高，脯氨酸含量明显降低[23]。相反，植物抗寒性研究中普遍认为脯氨酸是一类抗冻保护剂，其含量随着低温胁迫大幅度增加。因此，说明自由氨基酸在不同生物体耐寒中的作用机制并不相同。
1.6酶激活及离子平衡
无机离子（inorganic ions）是生命体不可缺少的一部分，在溶质的跨膜运动中扮演着重要的角色，如K 、Na 和Ca2 等。当昆虫受到低温胁迫时，体内会积累大量有毒代谢物质，碱性金属离子和各种酶类可以帮助调节机体受损，确保正常的新陈代谢。在低温暴露下，昆虫血淋巴中K 浓度显著增加，Na 浓度下降及肠道内水分流失[24]，这一观点在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中已经得到证实[25]。然而，东亚飞蝗（Locusta migratoria）经低温胁迫后血淋巴中K 浓度并未发生显著变化[26]。说明碱性金属离子在不同昆虫种类耐寒中的作用和变化动态并非一致，如低温暴露下，Ca2 在亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）中诱导快速冷驯化，刺激甘油合成[27]。
温度变化会通过一个信号传导系统激活糖原磷酸化酶，糖原和其他冷冻保护剂随着温度的变化相互转化。越冬过程中，温度或光周期刺激直接影响昆虫生长发育中的激素，改变合成多元醇的酶活机制，如保幼激素（JH）和保幼激素类似物（JHA）刺激二化螟幼虫体内甘油聚集，蜕皮激素则降低其甘油浓度[28]。SOD和CAT能够清除细胞内的活性氧、羟自由基及其他过氧化物，以免对细胞造成毒害[29]。LDH是糖酵解途径的关键酶之一，若其活性升高会直接影响昆虫体内能量代谢，促进新陈代谢，致使昆虫不耐寒。Na ，K ATP酶有促进离子运输的重要功能，低温诱导使离子在细胞内外平衡，启动相关生理生化反应[30]。如异色瓢虫经冷驯化处理后体内细胞保护酶超氧化物歧化酶（SOD）与过氧化氢酶（CAT）活性升高，与新陈代谢有关的乳酸脱氢酶（LDH）及Na ，K ATP酶活性降低[31]。
2昆虫耐寒性的分子机制
2.1抗冷保护剂基因调控
2.1.1脂类
脂肪酸脱饱和酶（fatty acid desaturase， FAD）是一类在脂肪酸链上将碳碳单键转化为碳碳双键的酶，是合成不饱和脂肪酸的关键酶[32]。昆虫中FAD保幼激素的种类很多，但主要属于FAD9（△9酰基辅酶脱饱和酶）和FAD11（△11酰基辅酶脱饱和酶）[3334]。在鱼类[35]、细菌[36]、植物[37]和昆虫[38]的耐低温研究中均证实了细胞膜上饱和脂肪酸转变成不饱和脂肪酸时，FAD9基因起到了非常关键的作用。关于FAD9基因序列已经在黑腹果蝇[39]、粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）[40]、家蚕（Bombyx mori）[41]和家蝇（Musca domestica）[42]中得到鉴定，序列在两端保守性低，但中间部分存在两个相对保守的疏水区，富含3个极保守的组氨酸基序和4 次跨膜结构域，这3个极保守的组氨酸基序与酶活性中心的形成相关，主要是螯合金属离子，结合氧[43]。 Kayukawa等[38]在葱地种蝇（Delia antiqua）中最先证实了FAD9基因与耐寒相关。随后，又有学者陆续在白纹伊蚊（Aedes albopictus）、麻蝇（Sarcophaga crassipalpis）等几种昆虫证实耐寒与FAD9基因有关[4445]。当温度降低时膜脂流动性减少，该信号激活FAD9合成不饱和脂肪酸用来提高昆虫耐寒性。FAD9在低温下有两种调节机制[35]：其一，当温度开始下降时，激活昆虫体内现有的FAD9基因，增加其活性，但表达量不变；其二，当温度继续下降时，FAD9基因表达量升高，酶活性也进一步增加。关于FAD调控脂肪酸代谢的机制至今研究还不够深入，有待进一步完善。
2.1.2甘油激酶
在低温状态时，昆虫合成多元醇等抗冻保护剂阻止细胞结冰，增加其适应性和生存能力。甘油是昆虫血淋巴中主要的抗冻保护剂之一[46]，具有两个独立的合成途径：一个是利用多元醇脱氢酶催化甘油醛和烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADPH H ）途径合成甘油[47]；另一个是利用甘油磷酸脱氢酶（GPDH）和葡萄糖激酶（GK）途径合成甘油[48]。小菜蛾通过后者完成甘油合成，其基因组注释中有4个葡萄糖激酶（GK）基因和1个甘油磷酸脱氢酶（GPDH）基因[49]，经RNAi验证GK1与耐寒相关[50]。GPDH可能在耐寒过程中起辅助作用，催化合成3磷酸甘油[51]，这一假设需要在其他昆虫中进一步研究证明。
2.1.3海藻糖
海藻糖也是昆虫血淋巴中主要的抗冻保护剂之一，由2个葡萄糖残基通过糖苷键结合而成[52]。海藻糖的合成途径有5 种，最主要的是TPS/TPP途径。这个途径中，海藻糖6磷酸合成酶起关键作用，即尿苷二磷酸葡萄糖和6磷酸葡萄糖在海藻糖6磷酸合成酶的催化作用下合成6磷酸海藻糖，然后在海藻糖6磷酸磷酸酯酶作用下生成海藻糖[53]。
随着季节变化，昆虫体内海藻糖在血淋巴中的含量也随之变化，秋季增加，冬季结束后下降[54]。同样，这一特性在低温条件或昆虫冬滞育中也存在[55]。完全处于冬滞育状态的苹果蠹蛾（Cydia pomonella）幼虫体内海藻糖含量比滞育初期的高3倍，而且海藻糖浓度与苹果蠹蛾幼虫过冷却能力和低温生存能力相关[56]。异色瓢虫在低温诱导下，TPS的表达量随着温度的降低而显著升高，在降温和升温处理条件下，TPS的表达量呈现先升高后下降的表达趋势[57]。进一步说明TPS基因的表达与耐寒相关。这一机制的研究为明确昆虫的耐寒途径提供了新的思路。
2.2抗冻蛋白和热滞活性
抗冻蛋白是一类具有热滞活性，吸附在冰核表面抑制冰核增长的冰结合蛋白，能够将冻结温度降到熔点之下，这一现象称作热滞作用。抗冻蛋白能将昆虫血淋巴的冰点降低超过5℃[58]。同时，抗冻蛋白还可改变冰晶形态、降低过冷却点、降低玻璃化和去玻璃化损伤，具有明显的季节性[59]。目前，至少有50种昆虫产生抗冻蛋白[60]。昆虫抗冻蛋白的分子量一般约为8～9 kD，无糖基化位点并且含有较多的亲水性氨基酸，有40%～50%的氨基酸残基能形成氢键。由于一些昆虫的抗冻蛋白相比鱼类，具有更强的抗冻能力[61]，因此，昆虫抗冻蛋白的研究成为生物技术的热门话题。
目前，尽管大部分昆虫抗冻蛋白研究集中在探索和测量血淋巴中热滞活性，但是也有少量昆虫的抗冻蛋白序列被测序并纯化，如：黄粉虫（Tenebrio molitor）、赤翅甲（Dendroides canadensis）、雪跳蚤（Hypogastrura harveyi）、枞色卷蛾（Choristoneura fumiferana）等[62]。比较这4种昆虫的抗冻蛋白序列，发现它们之间相似度非常低，表明昆虫抗冻蛋白之间由不同始祖独立进化而来，至少包含17个cf型亚族和13个D型亚族。同一基因不同的亚型多拷贝现象存在明显的适应性，因此，随着环境信号的改变，这些蛋白可能发挥不同的功能[63]。将抗冻蛋白转入昆虫细胞系中进行表达，可以控制神经内分泌，使生物体对环境因素诱导产生不敏感的反应[64]。也有研究表明，有些生物体转入抗冻蛋白基因后，提高了热滞活性，增强了抗冻能力；然而，也有些生物体转入抗冻蛋白基因后，虽然提高了热滞活性，但是抗冻能力并无明显差异[65]。可能存在如下原因[6667]：（1）抗冻蛋白是多基因家族，热滞活性不可能区分不同亚型的抗冻蛋白，不同形式抗冻蛋白亚型混合，产生了耐寒性；（2）细胞膜的稳定性对抗寒非常重要，即使转基因抗冻蛋白集中在细胞膜上且能正确翻译与修饰，但它们不可能无限制地稳定细胞膜；（3）稳定细胞膜抵抗低温需要一些协同作用的物质，如甘油。因此，昆虫体内抗冻蛋白的产生与抵抗低温的关系非常复杂，需要通过现代分子生物学手段进行深入研究。
2.3热休克蛋白
热休克蛋白（heat shock proteins， HSPs）是一种抗逆蛋白，通常被认为具有保护细胞不受伤害的作用。在大部分昆虫中，冷休克可以诱导热休克蛋白家族基因的表达，但在果蝇中，不管是冷胁迫还是快速冷驯化，HSP70的表达几乎恒定不变[68]。因此，在早期昆虫耐寒性研究中，黑腹果蝇不是理想的模式昆虫，HSP70不随着冷休克而上调，但这并不意味其他热休克蛋白基因也不变化，特别是小热休克蛋白基因家族，这一观念随着后来研究的深入得到了证实[69]，如HSP19.5，HSP20.8和HSP21.7在美洲斑潜蝇（Liriomyza sativae）耐寒中起到非常重要的作用，其中HSP20.8对低温更敏感[70]。
冬滞育在昆虫中普遍存在，其研究主要集中在热休克蛋白基因[71]。与滞育相关的基因有两种[72]：一种是直接调控滞育；另一种是辅助启动滞育机制。不同物种之间调控滞育的基因不同，如HSP90在麻蝇（S.crassipalpis）滞育中表达上调[73]，但在葱地种蝇（Delia antiqua）滞育中表达下调[74]，说明不同种类的昆虫参与耐寒调控的热休克蛋白并非一致。 热休克蛋白基因家族与滞育的关系非常复杂，主要受外部环境的刺激影响。麻蝇（S.crassipalpis）通过RNAi技术干扰HSP23和HSP70基因，并不影响其滞育，但影响蛹的耐寒性[75]。因此，HSP23和HSP70被认为主要与麻蝇越冬耐寒相关。
目前，确定与滞育触发相关的基因有两类[76]。一类是滞育激素，不同物种之间表现并非一致，滞育激素在家蚕中诱导胚胎滞育[77]，然而，在烟芽夜蛾（Heliothis virescens）[78]和棉铃虫（Helicoverpa armigera）[79]中解除滞育。另一类是P38 MAPK的磷酸化作用，在豆长刺萤叶甲（Atrachya menetriesi）[80]、家蚕（Bombyx mori）[81]和麻蝇（Sarcophaga crassipalpis）[82]等3种昆虫的滞育与解除中得到证实。p38 MAPK的磷酸化作用在诱导麻蝇进入快速冷驯化过程中起着关键作用，温度在0℃ 左右10 min内启动p38 MAPK磷酸化途径[83]。
2.4水通道蛋白
随着分子生物学高科技手段的发展与运用，生物体中仍然存在一些特殊的基因在耐寒中起着重要作用，如水通道蛋白就是其中之一。水通道蛋白是跨膜蛋白，可以选择性地让水或其他小分子物质通过细胞膜。目前，水通道蛋白在黑腹果蝇[84]、白纹伊蚊（A.albopictus）[85]、冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）[86]和Eurosta solidaginis[87]等昆虫中得到克隆并鉴定。通过免疫印迹法得知E.solidaginis水通道蛋白与哺乳动物同源，水通道蛋白的表达量与气候温度和干燥直接相关，抑制水通道蛋白活性可以明显降低E.solidaginis脂肪体和中肠细胞在低温下的存活[87]。由于水通道蛋白具有控制水分和甘油流动，增加渗透调节和代谢运输的功能，因此，可以推测水通道蛋白与耐寒性存在一定的关系，但需要进一步研究证实。
3展望
昆虫受低温胁迫时，会启动一系列抗寒机制。通过调控相关抗寒基因，合成抗逆物质，增加细胞内抗冻蛋白和热休克蛋白等提高抗寒能力，保护机体不受低温的伤害。同时，这一生理生化过程随着温度的恢复是可逆的。
昆虫耐寒性研究是昆虫生态学和生物进化学研究的热点，也为害虫的测报和防治提供理论基础[88]，尤其对新农药的开发提供了新的思路。
昆虫脂肪酸脱饱和酶在低温下促进不饱和脂肪酸的形成，减少膜脂流动性，提高耐寒性。因此，可以通过基因工程等相关手段开发新的生物制剂，阻断害虫体内脂肪酸脱饱和酶的活性，降低害虫耐寒能力，让其不能在低温条件下越冬，达到害虫防治的效果。同时，对于有益生物，也可以通过此方法保护其耐寒越冬。这一研究为今后的生产实践提供了广阔的思路。
昆虫体内冰核物质能够提高昆虫过冷却点，降低昆虫耐寒性，导致越冬昆虫大量死亡。若开发成新型的生物制剂，与其他防治方法配合使用，可能开辟一个全新的害虫防治领域，具有潜在的生态学意义。
总之，随着基因芯片、蛋白质组学、代谢组学和基因组学等的发展与应用，昆虫耐寒的生理生化机制逐渐清晰。尽管果蝇不适合作为耐寒研究的模式昆虫，但果蝇有完整的基因组序列、成熟的育种系、突变体和细胞系。根据果蝇的基因功能，推测其他昆虫某类基因的功能，再进行试验证明。研究昆虫的耐寒性机制，可为农业昆虫的测报提供理论参考，尤其对天敌昆虫的低温储存具有重要意义，同时，在新农药开发与利用方面具有较大前景。这些研究有望推动和促进害虫农业防治和生物防治事业的发展。
参考文献
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昆虫是变温动物，为了安全越冬，昆虫通常改变自身结构和物质构成以适应低温的到来，这一适应机制与体内特殊的生理生化物质紧密相关，如海藻糖、葡萄糖、甘油、山梨醇、脂肪酸和氨基酸等小分子抗冻保护剂。这些抗冻保护剂具有稳定细胞膜结构和保护蛋白质功能的作用。虽然昆虫耐寒性的研究不断深入，但目前我们仍然很难确定影响耐寒的关键因素是什么？为什么有些昆虫在低于-20℃环境下还能存活？为了弄清这一科学问题，科学家们利用转录组、基因组、蛋白质组和代谢组等各种组学剖析低温胁迫后昆虫生理反应的分子机制。本文旨在综述前人对昆虫耐寒性的研究，为将来其他昆虫或动植物的耐寒性研究提供参考依据。同时，也为新型生物农药的开发和天敌昆虫的人工助增提供广阔思路。
关键词
昆虫；耐寒性；抗冻保护剂；机制
中图分类号：
Q 965
文献标识码：A
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2016.06.003
Abstract
As ectothermic animals， insects usually convert its structure and physiological material composition in order to survive safely in winter. This adaptation mechanism is closely related to the special physiological and biochemical substances in the body， such as trehalose， dextrose， glycerol， sorbitol， fatty acids， amino acids and other frost protection agents of small molecules. These antifreeze agents have the function of stabilizing the cell membrane structure and protecting the protein function. Currently， research on the cold tolerance of insects is deepening， but it is still difficult to determine the key factors that affect the cold tolerance. Why some insects can survive below -20℃？ In order to clarify the scientific issues， a large number of scholars have used the theory of transcriptomics， genomics， proteomics and metabolomics to analyze the molecular mechanisms of insect physiological responses after low temperature stress. The purpose of this article is to review the cold tolerance aspects of previous studies and provide a reference for future studies of other insects or cold flora and fauna. At the same time， it also provides a broad way for the development of new biopesticides and increasing natural enemies of insects artificially.
Key words
insect；cold tolerance；frost protection agent；mechanism
昆虫耐寒性研究最早起源于18世纪30年代，Bachmetjew发现了昆虫的过冷却点[1]。直到20世纪60年代，Salt[2] 应用简单的仪器设备进行了昆虫耐低温的生理试验。随着科学技术的发展，许多高科技的手段被用于揭示低温生物学问题，比如：气相色谱、液相色谱、电泳法、差示扫描量热法、核磁共振光谱和各种组学，包括转录组、基因组、基因芯片、蛋白质组和代谢组等。
影响昆虫耐寒的因素主要包括生物因素和非生物因素。生物因素主要包括寄主营养、发育历期及雌雄差异等；非生物因素主要有季节性气温变化、快速冷驯化、环境湿度、光周期及不同地理位置等。昆虫耐寒是各种因素相互作用的结果[3]，并非单一的体系，而是由多种抗寒物质组成的复杂系统[46]。昆虫应对低温耐寒的对策主要分为两类：一类是行为对策，即生态适应对策，当冬季低温来临时，昆虫通过行为活动寻找合适的躲避场所，比如迁飞、休眠和滞育等；另一类是生理对策，即改变体内生理生化物质比例，提高耐寒性。目前，昆虫耐寒性研究主要围绕过冷却点、小分子抗冻保护剂、抗冻蛋白和热休克蛋白等方面进行机理解析[7]。然而，不同昆虫耐寒机理不尽相同，本文对前人的大量研究进行了综述。
1昆虫耐低温的生理生化机制
昆虫是变温动物，能否安全越冬直接关系到昆虫下一年种群的繁衍。19世纪60年代，人们开始意识到昆虫的耐寒性与昆虫自身生理调节紧密相关。
1.1过冷却点的降低
温度低于昆虫体液冰点而不凝固的现象称作过冷却现象。过冷却点是描述昆虫耐寒性的主要指标之一。昆虫的过冷却点在不同个体和群体之间差异很大，受环境、自身发育、机体代谢等多种因素影响，因此，这些因素也影响昆虫的耐寒性。进入过冷却状态是北半球温带和寒温带地区昆虫采取的主要越冬策略。苹淡褐卷蛾（Epiphyas postvittana）幼虫经冷驯化处理后，过冷却点和死亡率均明显降低[8]。美洲芹凤蝶（Papilio zelicaon）越冬蛹过冷却点为-20.5℃时，可以在-30℃幸存，但经春季暖温暴露后，过冷却点升为-17℃，在-20℃仅能存活1 h[9]。由此说明低温冷驯化对降低昆虫过冷却点至关重要，也是自然环境下昆虫能够正常越冬必不可少的步骤。 1.2体内冰核物质的排除与结构调整
生物体中常有异源催化物质，促使水分子重新排列，并在零下温度结冰，这种催化物质被称作冰核促成活性因子（ice nucleating active agents，INA），简称为冰核。早期在细菌的核中得到证实，细胞外膜上的蛋白、碳水化合物和脂类限制了冰核的形成。同样，在昆虫体液中，也存在冰核。除去冰核可以增加昆虫的耐寒性，提高小分子防冻保护剂的合成。食物和细菌在昆虫肠道内被认为是潜在的冰核物质，因此，在低温下可以通过停止取食的方式除去这些潜在的冰核物质。最近，Worland等[1011]在弹尾目昆虫中发现蜕皮可以降低过冷却点，可能由于弹尾目昆虫通过蜕皮脱掉了潜在的冰核物质。近年来通过基因芯片技术证明了蜕皮与过冷却点降低存在一定的联系。另外，冰核结构也是影响过冷却点的因素，不同的冰核结构有助于山楂粉蝶（Aporia crataegi）耐受-85℃低温[12]。因此，说明不同昆虫通过不同的途径处理冰核来达到抵抗低温的目的。
1.3小分子抗冻保护剂的积累
越冬昆虫体内聚集小分子抗冻保护剂，如甘油、多元醇、糖类等，可增加昆虫体内束缚水的含量；直接与酶及其他蛋白相互作用，提高昆虫机体的耐寒性。有研究报道，长角血蜱（Haemaphysalis longicornis）滞育卵中山梨醇和甘油的积累是重要的越冬抗冻保护剂[13]；冰川摇蚊（Pseudodiamesa branickii）体内主要以葡萄糖和蔗糖作为小分子抗冻保护剂[14]；大螟（Sesamia inferens）体内小分子抗冻保护剂，如甘油、海藻糖、果糖、葡萄糖和肌醇含量的变化与季节气温波动完全吻合[15]。因此，说明昆虫抵抗低温并非单一物质行为，而是存在多元抗冻保护系统。
1.4脂类的转化
目前，研究与耐寒相关的脂类主要有软脂酸、亚油酸、脂肪酸酯和油酸等。脂肪是生物体的三大基础物质之一，具有贮能和保温等功能，同时在低温耐寒方面起着非常重要的作用[1618]。昆虫脂肪耐寒主要表现在：其一，脂肪具有贮能、供能的功效，如低温饲养条件下剑川无钩蝠蛾（Hepialus jianchuanensis）幼虫体内脂肪含量明显高于较高温度饲养的个体[19]；其二，脂肪可以减少昆虫体内自由水含量，从而增加其耐寒性[20]；其三，游离脂肪含量影响昆虫过冷却点的变化。作为脂肪代谢产物的甘油可以降低白蜡窄吉丁（Agrilus planipennis）的过冷却点，保护其组织不受低温的伤害[21]。
脂肪酸是脂肪合成的底物，因此，它与昆虫的耐寒性有着紧密的联系。一般情况下，随着温度的降低，不饱和脂肪酸含量升高，饱和脂肪酸含量降低，增加昆虫体内不饱和脂肪酸含量可以阻止细胞膜脂在低温下结晶。Nieminen等[22]的研究表明，颈利虱蝇（Lipoptena cervi）体内不饱和脂肪酸含量在晚秋季节显著高于夏季。
脂肪参与昆虫体内各种代谢反应，直接或间接地影响昆虫的多种生理反应。同时，脂肪含量的变化影响昆虫耐寒性的机制也并非单一，因此，需要进一步从分子层面深入研究。
1.5自由氨基酸的合成
温度胁迫也能触发昆虫体内自由氨基酸的代谢反应。在低温条件下，自由氨基酸对昆虫机体具有抗冻保护的作用。蠋蝽（Arma chinensis）经快速冷驯化处理后，体内自由氨基酸含量发生较大变化，其中丙氨酸和谷氨酸含量明显升高，脯氨酸含量明显降低[23]。相反，植物抗寒性研究中普遍认为脯氨酸是一类抗冻保护剂，其含量随着低温胁迫大幅度增加。因此，说明自由氨基酸在不同生物体耐寒中的作用机制并不相同。
1.6酶激活及离子平衡
无机离子（inorganic ions）是生命体不可缺少的一部分，在溶质的跨膜运动中扮演着重要的角色，如K 、Na 和Ca2 等。当昆虫受到低温胁迫时，体内会积累大量有毒代谢物质，碱性金属离子和各种酶类可以帮助调节机体受损，确保正常的新陈代谢。在低温暴露下，昆虫血淋巴中K 浓度显著增加，Na 浓度下降及肠道内水分流失[24]，这一观点在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中已经得到证实[25]。然而，东亚飞蝗（Locusta migratoria）经低温胁迫后血淋巴中K 浓度并未发生显著变化[26]。说明碱性金属离子在不同昆虫种类耐寒中的作用和变化动态并非一致，如低温暴露下，Ca2 在亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）中诱导快速冷驯化，刺激甘油合成[27]。
温度变化会通过一个信号传导系统激活糖原磷酸化酶，糖原和其他冷冻保护剂随着温度的变化相互转化。越冬过程中，温度或光周期刺激直接影响昆虫生长发育中的激素，改变合成多元醇的酶活机制，如保幼激素（JH）和保幼激素类似物（JHA）刺激二化螟幼虫体内甘油聚集，蜕皮激素则降低其甘油浓度[28]。SOD和CAT能够清除细胞内的活性氧、羟自由基及其他过氧化物，以免对细胞造成毒害[29]。LDH是糖酵解途径的关键酶之一，若其活性升高会直接影响昆虫体内能量代谢，促进新陈代谢，致使昆虫不耐寒。Na ，K ATP酶有促进离子运输的重要功能，低温诱导使离子在细胞内外平衡，启动相关生理生化反应[30]。如异色瓢虫经冷驯化处理后体内细胞保护酶超氧化物歧化酶（SOD）与过氧化氢酶（CAT）活性升高，与新陈代谢有关的乳酸脱氢酶（LDH）及Na ，K ATP酶活性降低[31]。
2昆虫耐寒性的分子机制
2.1抗冷保护剂基因调控
2.1.1脂类
脂肪酸脱饱和酶（fatty acid desaturase， FAD）是一类在脂肪酸链上将碳碳单键转化为碳碳双键的酶，是合成不饱和脂肪酸的关键酶[32]。昆虫中FAD保幼激素的种类很多，但主要属于FAD9（△9酰基辅酶脱饱和酶）和FAD11（△11酰基辅酶脱饱和酶）[3334]。在鱼类[35]、细菌[36]、植物[37]和昆虫[38]的耐低温研究中均证实了细胞膜上饱和脂肪酸转变成不饱和脂肪酸时，FAD9基因起到了非常关键的作用。关于FAD9基因序列已经在黑腹果蝇[39]、粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）[40]、家蚕（Bombyx mori）[41]和家蝇（Musca domestica）[42]中得到鉴定，序列在两端保守性低，但中间部分存在两个相对保守的疏水区，富含3个极保守的组氨酸基序和4 次跨膜结构域，这3个极保守的组氨酸基序与酶活性中心的形成相关，主要是螯合金属离子，结合氧[43]。 Kayukawa等[38]在葱地种蝇（Delia antiqua）中最先证实了FAD9基因与耐寒相关。随后，又有学者陆续在白纹伊蚊（Aedes albopictus）、麻蝇（Sarcophaga crassipalpis）等几种昆虫证实耐寒与FAD9基因有关[4445]。当温度降低时膜脂流动性减少，该信号激活FAD9合成不饱和脂肪酸用来提高昆虫耐寒性。FAD9在低温下有两种调节机制[35]：其一，当温度开始下降时，激活昆虫体内现有的FAD9基因，增加其活性，但表达量不变；其二，当温度继续下降时，FAD9基因表达量升高，酶活性也进一步增加。关于FAD调控脂肪酸代谢的机制至今研究还不够深入，有待进一步完善。
2.1.2甘油激酶
在低温状态时，昆虫合成多元醇等抗冻保护剂阻止细胞结冰，增加其适应性和生存能力。甘油是昆虫血淋巴中主要的抗冻保护剂之一[46]，具有两个独立的合成途径：一个是利用多元醇脱氢酶催化甘油醛和烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADPH H ）途径合成甘油[47]；另一个是利用甘油磷酸脱氢酶（GPDH）和葡萄糖激酶（GK）途径合成甘油[48]。小菜蛾通过后者完成甘油合成，其基因组注释中有4个葡萄糖激酶（GK）基因和1个甘油磷酸脱氢酶（GPDH）基因[49]，经RNAi验证GK1与耐寒相关[50]。GPDH可能在耐寒过程中起辅助作用，催化合成3磷酸甘油[51]，这一假设需要在其他昆虫中进一步研究证明。
2.1.3海藻糖
海藻糖也是昆虫血淋巴中主要的抗冻保护剂之一，由2个葡萄糖残基通过糖苷键结合而成[52]。海藻糖的合成途径有5 种，最主要的是TPS/TPP途径。这个途径中，海藻糖6磷酸合成酶起关键作用，即尿苷二磷酸葡萄糖和6磷酸葡萄糖在海藻糖6磷酸合成酶的催化作用下合成6磷酸海藻糖，然后在海藻糖6磷酸磷酸酯酶作用下生成海藻糖[53]。
随着季节变化，昆虫体内海藻糖在血淋巴中的含量也随之变化，秋季增加，冬季结束后下降[54]。同样，这一特性在低温条件或昆虫冬滞育中也存在[55]。完全处于冬滞育状态的苹果蠹蛾（Cydia pomonella）幼虫体内海藻糖含量比滞育初期的高3倍，而且海藻糖浓度与苹果蠹蛾幼虫过冷却能力和低温生存能力相关[56]。异色瓢虫在低温诱导下，TPS的表达量随着温度的降低而显著升高，在降温和升温处理条件下，TPS的表达量呈现先升高后下降的表达趋势[57]。进一步说明TPS基因的表达与耐寒相关。这一机制的研究为明确昆虫的耐寒途径提供了新的思路。
2.2抗冻蛋白和热滞活性
抗冻蛋白是一类具有热滞活性，吸附在冰核表面抑制冰核增长的冰结合蛋白，能够将冻结温度降到熔点之下，这一现象称作热滞作用。抗冻蛋白能将昆虫血淋巴的冰点降低超过5℃[58]。同时，抗冻蛋白还可改变冰晶形态、降低过冷却点、降低玻璃化和去玻璃化损伤，具有明显的季节性[59]。目前，至少有50种昆虫产生抗冻蛋白[60]。昆虫抗冻蛋白的分子量一般约为8～9 kD，无糖基化位点并且含有较多的亲水性氨基酸，有40%～50%的氨基酸残基能形成氢键。由于一些昆虫的抗冻蛋白相比鱼类，具有更强的抗冻能力[61]，因此，昆虫抗冻蛋白的研究成为生物技术的热门话题。
目前，尽管大部分昆虫抗冻蛋白研究集中在探索和测量血淋巴中热滞活性，但是也有少量昆虫的抗冻蛋白序列被测序并纯化，如：黄粉虫（Tenebrio molitor）、赤翅甲（Dendroides canadensis）、雪跳蚤（Hypogastrura harveyi）、枞色卷蛾（Choristoneura fumiferana）等[62]。比较这4种昆虫的抗冻蛋白序列，发现它们之间相似度非常低，表明昆虫抗冻蛋白之间由不同始祖独立进化而来，至少包含17个cf型亚族和13个D型亚族。同一基因不同的亚型多拷贝现象存在明显的适应性，因此，随着环境信号的改变，这些蛋白可能发挥不同的功能[63]。将抗冻蛋白转入昆虫细胞系中进行表达，可以控制神经内分泌，使生物体对环境因素诱导产生不敏感的反应[64]。也有研究表明，有些生物体转入抗冻蛋白基因后，提高了热滞活性，增强了抗冻能力；然而，也有些生物体转入抗冻蛋白基因后，虽然提高了热滞活性，但是抗冻能力并无明显差异[65]。可能存在如下原因[6667]：（1）抗冻蛋白是多基因家族，热滞活性不可能区分不同亚型的抗冻蛋白，不同形式抗冻蛋白亚型混合，产生了耐寒性；（2）细胞膜的稳定性对抗寒非常重要，即使转基因抗冻蛋白集中在细胞膜上且能正确翻译与修饰，但它们不可能无限制地稳定细胞膜；（3）稳定细胞膜抵抗低温需要一些协同作用的物质，如甘油。因此，昆虫体内抗冻蛋白的产生与抵抗低温的关系非常复杂，需要通过现代分子生物学手段进行深入研究。
2.3热休克蛋白
热休克蛋白（heat shock proteins， HSPs）是一种抗逆蛋白，通常被认为具有保护细胞不受伤害的作用。在大部分昆虫中，冷休克可以诱导热休克蛋白家族基因的表达，但在果蝇中，不管是冷胁迫还是快速冷驯化，HSP70的表达几乎恒定不变[68]。因此，在早期昆虫耐寒性研究中，黑腹果蝇不是理想的模式昆虫，HSP70不随着冷休克而上调，但这并不意味其他热休克蛋白基因也不变化，特别是小热休克蛋白基因家族，这一观念随着后来研究的深入得到了证实[69]，如HSP19.5，HSP20.8和HSP21.7在美洲斑潜蝇（Liriomyza sativae）耐寒中起到非常重要的作用，其中HSP20.8对低温更敏感[70]。
冬滞育在昆虫中普遍存在，其研究主要集中在热休克蛋白基因[71]。与滞育相关的基因有两种[72]：一种是直接调控滞育；另一种是辅助启动滞育机制。不同物种之间调控滞育的基因不同，如HSP90在麻蝇（S.crassipalpis）滞育中表达上调[73]，但在葱地种蝇（Delia antiqua）滞育中表达下调[74]，说明不同种类的昆虫参与耐寒调控的热休克蛋白并非一致。 热休克蛋白基因家族与滞育的关系非常复杂，主要受外部环境的刺激影响。麻蝇（S.crassipalpis）通过RNAi技术干扰HSP23和HSP70基因，并不影响其滞育，但影响蛹的耐寒性[75]。因此，HSP23和HSP70被认为主要与麻蝇越冬耐寒相关。
目前，确定与滞育触发相关的基因有两类[76]。一类是滞育激素，不同物种之间表现并非一致，滞育激素在家蚕中诱导胚胎滞育[77]，然而，在烟芽夜蛾（Heliothis virescens）[78]和棉铃虫（Helicoverpa armigera）[79]中解除滞育。另一类是P38 MAPK的磷酸化作用，在豆长刺萤叶甲（Atrachya menetriesi）[80]、家蚕（Bombyx mori）[81]和麻蝇（Sarcophaga crassipalpis）[82]等3种昆虫的滞育与解除中得到证实。p38 MAPK的磷酸化作用在诱导麻蝇进入快速冷驯化过程中起着关键作用，温度在0℃ 左右10 min内启动p38 MAPK磷酸化途径[83]。
2.4水通道蛋白
随着分子生物学高科技手段的发展与运用，生物体中仍然存在一些特殊的基因在耐寒中起着重要作用，如水通道蛋白就是其中之一。水通道蛋白是跨膜蛋白，可以选择性地让水或其他小分子物质通过细胞膜。目前，水通道蛋白在黑腹果蝇[84]、白纹伊蚊（A.albopictus）[85]、冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）[86]和Eurosta solidaginis[87]等昆虫中得到克隆并鉴定。通过免疫印迹法得知E.solidaginis水通道蛋白与哺乳动物同源，水通道蛋白的表达量与气候温度和干燥直接相关，抑制水通道蛋白活性可以明显降低E.solidaginis脂肪体和中肠细胞在低温下的存活[87]。由于水通道蛋白具有控制水分和甘油流动，增加渗透调节和代谢运输的功能，因此，可以推测水通道蛋白与耐寒性存在一定的关系，但需要进一步研究证实。
3展望
昆虫受低温胁迫时，会启动一系列抗寒机制。通过调控相关抗寒基因，合成抗逆物质，增加细胞内抗冻蛋白和热休克蛋白等提高抗寒能力，保护机体不受低温的伤害。同时，这一生理生化过程随着温度的恢复是可逆的。
昆虫耐寒性研究是昆虫生态学和生物进化学研究的热点，也为害虫的测报和防治提供理论基础[88]，尤其对新农药的开发提供了新的思路。
昆虫脂肪酸脱饱和酶在低温下促进不饱和脂肪酸的形成，减少膜脂流动性，提高耐寒性。因此，可以通过基因工程等相关手段开发新的生物制剂，阻断害虫体内脂肪酸脱饱和酶的活性，降低害虫耐寒能力，让其不能在低温条件下越冬，达到害虫防治的效果。同时，对于有益生物，也可以通过此方法保护其耐寒越冬。这一研究为今后的生产实践提供了广阔的思路。
昆虫体内冰核物质能够提高昆虫过冷却点，降低昆虫耐寒性，导致越冬昆虫大量死亡。若开发成新型的生物制剂，与其他防治方法配合使用，可能开辟一个全新的害虫防治领域，具有潜在的生态学意义。
总之，随着基因芯片、蛋白质组学、代谢组学和基因组学等的发展与应用，昆虫耐寒的生理生化机制逐渐清晰。尽管果蝇不适合作为耐寒研究的模式昆虫，但果蝇有完整的基因组序列、成熟的育种系、突变体和细胞系。根据果蝇的基因功能，推测其他昆虫某类基因的功能，再进行试验证明。研究昆虫的耐寒性机制，可为农业昆虫的测报提供理论参考，尤其对天敌昆虫的低温储存具有重要意义，同时，在新农药开发与利用方面具有较大前景。这些研究有望推动和促进害虫农业防治和生物防治事业的发展。
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