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[摘要]目的 通过比较Nesprin 1在不同癌细胞中的表达程度，为Nesprin 1与多种癌细胞之间的关系做初步探讨。方法 采用Western blotting方法检测Nesprin 1在人宫颈癌细胞（Hela）、人肺癌细胞（H-125）、人乳腺癌细胞（HCC-1937）、人膀胱癌细胞（5637）、人肝癌细胞（HepG2）、人胃癌细胞（BGC-823）、人结肠癌细胞（HCT 116）、人食管癌细胞（Eca-109）、小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（Raw 2647）等癌细胞当中的表达。结果 各癌细胞组GAPDH均有表达，Nesprin 1各组表达量不同，从强到弱顺序为HCC-1937>H-125>HCTll6=Eca-109>RAW2647>BGC-823>HepG2>Hela>5637，其中人膀胱癌细胞5637的表达不明显。结论 Nesprin 1蛋白可在多种癌细胞中表达，膀胱癌细胞中表达不明显。
[关键词]Nesprin；癌症；肺癌；肝癌；胃癌；Hela；HCC-1937
[中图分类号]R34 [文献标识码]A [文章编号]2095-0616（2016）11-31-03
癌症是被预测为21世纪人类“第一杀手”的疾病。现常见的癌症有肺癌、肝癌、胃癌、血癌、肠癌、乳腺癌、食道癌、淋巴癌及肾癌等，其中前三者已成为我国癌症中致死率最高的三大疾病。在癌症的发生发展过程中，癌细胞是产生癌症的源头，癌细胞的疯狂增殖、浸润及侵袭是由多种因素作用的结果，人类的干预手段是否有效可以通过调节癌细胞的各种蛋白及核酸的表达来判断，其表达并不是单型，而是由多种因子组成。
Nesprin是核膜蛋白的组成部分，是一个含多个重复序列的核骨架和细胞骨架蛋白家族。目前已发现此家族由4个基因编码组成，即Nesprin 1、Nesprin 2、Nesprin 3、Nesprin 4，其中Nesprin 1是目前研究较多的蛋白之一。最近有关nesprin家族细胞功能与肿瘤关系的研究成为热点，认为其下调或编码的基因突变可能参与肿瘤的形成，为此可以作为肿瘤诊断和治疗的靶点。不同的肿瘤其发生、发展的过程有所不同。本研究预同时观察Nesprin 1在十种常见肿瘤中的表达情况，为进一步Nesprin 1在肿瘤诊断和治疗中作用的研究提供线索。
1材料与方法
1.1细胞来源及主要试剂
1.1.1细胞 人宫颈癌细胞（Hela）、人肺癌细胞（H-125）、人乳腺癌细胞（HCC-1937）、人膀胱癌细胞（5637）、人肝癌细胞（HepG2）、人胃癌细胞（BGC-823）、人结肠癌细胞（HCT 116）、人食管癌细胞（Eea-109）、小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（Raw2647）均由上海吉凯基因提供。
1.1.2试剂 兔单克隆抗体Nesprin 1购于英国Abeam公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒，江苏碧云天公司；RIPA强裂解液，江苏碧云天公司；Prestained protein marker，美国Thermo公司；ECL-PLUS/kit，美国Thermo公司。
1.1.3仪器 SDS-PAGE蛋白电泳仪（VE-180），上海天能公司；蛋白转膜仪（VE-186），上海天能公司；冷冻高速离心机，美国Thermo公司；PVDF膜（IPVH00010），millipore公司。
1.2方法
采用Western blotting方法检测Nesprin 1的表达：收集九种癌细胞，提取蛋白，用BCA法测定蛋白质含量，进行SDS-PAGE、转膜、封闭后加入抗Nesprin 1多抗（TBST 1：1000稀释）4℃过夜；加入rabbit IgG（TBST 1：5000稀释），室温下孵育1.5h，TBST洗膜，加入ECL底物反应液，放上x线片，关上暗盒，曝光2min；取出光片，放入显影液中1min，漂洗后放定影液2min曝光。用目的条带的灰度值比内参GAPDH灰度值代表蛋白相对表达量。
1.3统计学方法
所有数据用SPSS13.0软件进行统计分析，计量资料服从正态分布用（x±s）表示，多组数据比较采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD法检验（α=0.05）。
2结果
Western blotting结果显示（见图1）：各癌细胞组内参（GAPDH）均有表达。除人膀胱癌细胞5637的Nesprin 1表达不明显外，其余各组均有不同程度表达，根据Nesprin 1蛋白相对表达量比较得出（见图2），其表达强弱顺序为HCC-1937>H-125>HCT116=Eca-109>RAW2647>BGC-823>HepG2>Hela>5637。H-125与HCC-1937两组的蛋白水平表达相较于其余组最高（均P<0.05），其中HCC-1937的蛋白表达相对H125更高（P<0.05）。HCT116与Eca-109之间无差异（P>0.05），其余各组细胞间均存在明显差异（均P<0.05）。见表1。
3讨论
本实验中所选癌细胞有Hela、H-125、HCC-1937、5637、HepG2、BGC-823、HCT 116和Eca-109八种，均为临床上常见疾病，其种系为我国目前研究种类较多，使用频率较高的类型。可以看到相对于同一参照，不同癌细胞的表达量不一致，其中以人乳腺癌细胞和肺癌细胞含量最高，而膀胱癌细胞最低。目前国内有关癌细胞与Nesprin 1关系研究报道尚未发现，国外一项研究报道，在人类很多的癌症早期（包括卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、肾癌、肺癌、甲状腺癌、胰腺癌等）均发现Nesprin 1的N’端的同形异构体表达下调，不同癌细胞其表达量不同，以肺腺癌细胞（Calu3）、乳腺癌细胞（MCF7）、宫颈癌细胞（Hela）和卵巢癌某些类型（Caov-3、SK-OV-3）表达量较高；而且同样是卵巢癌细胞，其来源不同，Nesprin 1的DNA表达含量有所不同，与本研究结果类似，亚细胞定位的个体nesprin的变化由细胞类型决定，提示由于不同细胞类型Nesprin的功能不同，其Nesprin 1表达程度也不同。
癌细胞表现为核异型性，与正常细胞的核结构存在显著差异。细胞核的变形通常用于癌症的病理诊断及抗癌疗效的评价指标。Nesprin蛋白家族是细胞核膜蛋白的重要组成部分，核内膜的Nesprin蛋白家族和核外膜的SUN蛋白家族在细胞核周围相互作用共同构成了核一细胞骨架链接。当这种链接破坏，信号通路的损害带来了细胞核稳定性、大小、形态和位置的改变，并影响细胞的迁移、分化。因此很多研究学者认为Nesprin蛋白家族做为核一细胞骨架的重要组成部分，其异常必然与癌症相关。现有研究不仅发现Nesprin 1可能在人类很多癌症早期就已发挥作用，还可能与乳腺癌的恶化进展有关。另有研究报道，在卵巢癌和结肠直肠癌中编码Nesprin 1蛋白的SYNE1存在基因突变，肺癌和结肠直癌中SYNE1基因存在频繁的甲基化，并证实SYNE1参与了胶质细胞瘤的恶化。
本实验没有设立正常组织对照组，无法得出Nesprin 1与这些肿瘤的相关性，但依然可以看到不同癌细胞的表达量不一致。了解Nesprin 1在不同癌细胞的表达程度，有助于为进一步探讨Nesprin 1在肿瘤诊断和防治中的作用。本实验中，人膀胱癌细胞的Nesprin 1的表达量相较于其他癌细胞较低，是否可以作为鉴别诊断的指标？这需要我们的进一步验证。
[关键词]Nesprin；癌症；肺癌；肝癌；胃癌；Hela；HCC-1937
[中图分类号]R34 [文献标识码]A [文章编号]2095-0616（2016）11-31-03
癌症是被预测为21世纪人类“第一杀手”的疾病。现常见的癌症有肺癌、肝癌、胃癌、血癌、肠癌、乳腺癌、食道癌、淋巴癌及肾癌等，其中前三者已成为我国癌症中致死率最高的三大疾病。在癌症的发生发展过程中，癌细胞是产生癌症的源头，癌细胞的疯狂增殖、浸润及侵袭是由多种因素作用的结果，人类的干预手段是否有效可以通过调节癌细胞的各种蛋白及核酸的表达来判断，其表达并不是单型，而是由多种因子组成。
Nesprin是核膜蛋白的组成部分，是一个含多个重复序列的核骨架和细胞骨架蛋白家族。目前已发现此家族由4个基因编码组成，即Nesprin 1、Nesprin 2、Nesprin 3、Nesprin 4，其中Nesprin 1是目前研究较多的蛋白之一。最近有关nesprin家族细胞功能与肿瘤关系的研究成为热点，认为其下调或编码的基因突变可能参与肿瘤的形成，为此可以作为肿瘤诊断和治疗的靶点。不同的肿瘤其发生、发展的过程有所不同。本研究预同时观察Nesprin 1在十种常见肿瘤中的表达情况，为进一步Nesprin 1在肿瘤诊断和治疗中作用的研究提供线索。
1材料与方法
1.1细胞来源及主要试剂
1.1.1细胞 人宫颈癌细胞（Hela）、人肺癌细胞（H-125）、人乳腺癌细胞（HCC-1937）、人膀胱癌细胞（5637）、人肝癌细胞（HepG2）、人胃癌细胞（BGC-823）、人结肠癌细胞（HCT 116）、人食管癌细胞（Eea-109）、小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（Raw2647）均由上海吉凯基因提供。
1.1.2试剂 兔单克隆抗体Nesprin 1购于英国Abeam公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒，江苏碧云天公司；RIPA强裂解液，江苏碧云天公司；Prestained protein marker，美国Thermo公司；ECL-PLUS/kit，美国Thermo公司。
1.1.3仪器 SDS-PAGE蛋白电泳仪（VE-180），上海天能公司；蛋白转膜仪（VE-186），上海天能公司；冷冻高速离心机，美国Thermo公司；PVDF膜（IPVH00010），millipore公司。
1.2方法
采用Western blotting方法检测Nesprin 1的表达：收集九种癌细胞，提取蛋白，用BCA法测定蛋白质含量，进行SDS-PAGE、转膜、封闭后加入抗Nesprin 1多抗（TBST 1：1000稀释）4℃过夜；加入rabbit IgG（TBST 1：5000稀释），室温下孵育1.5h，TBST洗膜，加入ECL底物反应液，放上x线片，关上暗盒，曝光2min；取出光片，放入显影液中1min，漂洗后放定影液2min曝光。用目的条带的灰度值比内参GAPDH灰度值代表蛋白相对表达量。
1.3统计学方法
所有数据用SPSS13.0软件进行统计分析，计量资料服从正态分布用（x±s）表示，多组数据比较采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD法检验（α=0.05）。
2结果
Western blotting结果显示（见图1）：各癌细胞组内参（GAPDH）均有表达。除人膀胱癌细胞5637的Nesprin 1表达不明显外，其余各组均有不同程度表达，根据Nesprin 1蛋白相对表达量比较得出（见图2），其表达强弱顺序为HCC-1937>H-125>HCT116=Eca-109>RAW2647>BGC-823>HepG2>Hela>5637。H-125与HCC-1937两组的蛋白水平表达相较于其余组最高（均P<0.05），其中HCC-1937的蛋白表达相对H125更高（P<0.05）。HCT116与Eca-109之间无差异（P>0.05），其余各组细胞间均存在明显差异（均P<0.05）。见表1。
3讨论
本实验中所选癌细胞有Hela、H-125、HCC-1937、5637、HepG2、BGC-823、HCT 116和Eca-109八种，均为临床上常见疾病，其种系为我国目前研究种类较多，使用频率较高的类型。可以看到相对于同一参照，不同癌细胞的表达量不一致，其中以人乳腺癌细胞和肺癌细胞含量最高，而膀胱癌细胞最低。目前国内有关癌细胞与Nesprin 1关系研究报道尚未发现，国外一项研究报道，在人类很多的癌症早期（包括卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、肾癌、肺癌、甲状腺癌、胰腺癌等）均发现Nesprin 1的N’端的同形异构体表达下调，不同癌细胞其表达量不同，以肺腺癌细胞（Calu3）、乳腺癌细胞（MCF7）、宫颈癌细胞（Hela）和卵巢癌某些类型（Caov-3、SK-OV-3）表达量较高；而且同样是卵巢癌细胞，其来源不同，Nesprin 1的DNA表达含量有所不同，与本研究结果类似，亚细胞定位的个体nesprin的变化由细胞类型决定，提示由于不同细胞类型Nesprin的功能不同，其Nesprin 1表达程度也不同。
癌细胞表现为核异型性，与正常细胞的核结构存在显著差异。细胞核的变形通常用于癌症的病理诊断及抗癌疗效的评价指标。Nesprin蛋白家族是细胞核膜蛋白的重要组成部分，核内膜的Nesprin蛋白家族和核外膜的SUN蛋白家族在细胞核周围相互作用共同构成了核一细胞骨架链接。当这种链接破坏，信号通路的损害带来了细胞核稳定性、大小、形态和位置的改变，并影响细胞的迁移、分化。因此很多研究学者认为Nesprin蛋白家族做为核一细胞骨架的重要组成部分，其异常必然与癌症相关。现有研究不仅发现Nesprin 1可能在人类很多癌症早期就已发挥作用，还可能与乳腺癌的恶化进展有关。另有研究报道，在卵巢癌和结肠直肠癌中编码Nesprin 1蛋白的SYNE1存在基因突变，肺癌和结肠直癌中SYNE1基因存在频繁的甲基化，并证实SYNE1参与了胶质细胞瘤的恶化。
本实验没有设立正常组织对照组，无法得出Nesprin 1与这些肿瘤的相关性，但依然可以看到不同癌细胞的表达量不一致。了解Nesprin 1在不同癌细胞的表达程度，有助于为进一步探讨Nesprin 1在肿瘤诊断和防治中的作用。本实验中，人膀胱癌细胞的Nesprin 1的表达量相较于其他癌细胞较低，是否可以作为鉴别诊断的指标？这需要我们的进一步验证。