【摘 要】
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为进一步了解缺氧性心血管疾病的发病机制,通过使用CHIR99021和IWP2抑制剂的组合诱导和单层诱导分化方法获得人诱导性多能干细胞来源心肌细胞(Human induced pluripotent ste
【机 构】
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浙江理工大学生命科学与医药学院,杭州310018;杭州标模生物科技有限公司,杭州310018;上海丽坤生物科技股份有限公司,上海201499
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为进一步了解缺氧性心血管疾病的发病机制,通过使用CHIR99021和IWP2抑制剂的组合诱导和单层诱导分化方法获得人诱导性多能干细胞来源心肌细胞(Human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes,hiPSC-CMs),并在hiPSC-CMs的培养系统中加入氯化钴进行处理,通过CCK-8检测、Hoechst荧光染色分析、台盼蓝染色分析、qRT-PCR检测和Western blot检测确定最佳处理浓度和时间.CCK-8检测结果显示,低浓度CoCl2(100、300 μmol/L)处理显著提高hiPSC-CMs 细胞活力(p＜0.01),高浓度CoCl2(900、1200 μmol/L)处理显著抑制hiPSC-CMs细胞活力(p＜0.001),并且作用趋势呈剂量和时间依赖性,600 μmol/L CoCl2处理对于hiPSC-CMs的细胞活力影响不明显(p＜0.05);Hoechst荧光染色结果显示,CoCl2处理24 h和48 h后,低浓度CoCl2处理对细胞无影响,Hoechst染色阳性细胞数量少(p＞0.05),高浓度CoCl2处理剂量依赖性增加阳性细胞数量(p＜0.0001),且48 h处理组的结果与24 h处理组无显著差异;台盼蓝染色结果表明,CoCl2处理可剂量依赖性促进细胞凋亡;CoCl2处理后,促凋亡相关基因Bax和蛋白Bax表达呈剂量依赖性上调(p＜0.001),抗凋亡相关基因Bcl-2和蛋白Bcl-2表达呈剂量依赖性下调(p＜0.001);CoCl2处理可剂量依赖性促进hiPSC-CMs细胞的凋亡.通过qRT-PCR检测和Western blot检测确定600 μmol/L为最佳处理浓度,24 h为最佳处理时间,证明了该处理条件既不影响hiPSC-CMs细胞活力又可致其缺氧凋亡,建立了氯化钴诱导的hiPSC-CMs体外缺氧模型.论文结果为体外探索缺氧引起的心血管疾病的发病机理和寻找新的治疗靶点与药物提供了可靠的工具.
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