探讨抑癌基因p14ARF对顺铂诱导的骨肉瘤细胞凋亡的影响及其作用机制。
方法在不表达p14ARF的MG63细胞(p53突变)中稳定转染pcDNA3.1–p14ARF质粒，构建稳定表达株MG63–ARF；经反向聚合酶链反应(RT–PCR)和免疫印迹法鉴定；使用顺铂处理MG63和MG63–ARF细胞，通过MTT法测定细胞生长抑制和IC50；采用流式细胞术和Hoechst 33258荧光染色检测细胞凋亡；采用免疫印迹检测p53、Bax、p21、Mdm2、Fas、Caspase–3、Caspase–9、PARP的表达；通过RNA干扰进行p53的表达沉默。采用Caspase–9抑制剂Z–LEHD– FMK预处理各组细胞，检测该作用是否依赖Caspase–9。
结果mRNA和蛋白水平，MG63和MG63–vec细胞未见p14ARF表达，MG63–ARF细胞可见p14ARF的高表达。经顺铂处理72 h后，细胞活力在MG63、MG63–vec和MG63–ARF组为84.2%±4.3%、80.8%±4.3%和58.9%±5.4%，IC50值为(11.1±0.6)、(10.7±0.9)、(7.2±0.7) μmol/L，(P<0.05)。流式细胞术显示MG63、MG63–vec和MG63–ARF组经顺铂处理72 h的凋亡率为：13.6%、18.5%和35.9%。荧光染色表明MG63–ARF细胞相对出现更多更明显的凋亡，在MG63–ARF还出现了更明显的Caspase–3, 9和PARP的活化裂解。在顺铂处理的MG63–vec和MG63–ARF细胞中，p53、Bax、p21、Mdm2、Fas的表达无任何改变。在U2OS–vec和U2OS–ARF细胞中转染p53–siRNA明显减弱了p53的表达，再经顺铂处理72 h后，U2OS–vec细胞的转染空白组、转染对照siRNA组和转染p53–siRNA组细胞活力差异无统计学意义(P>0.05)，U2OS–ARF细胞的转染空白组、转染对照siRNA组和转染p53–siRNA组细胞活力差异无统计学意义(P>0.05)。Caspase–9抑制剂Z–LEHD– FMK预处理后，Z–LEHD–FMK、顺铂、顺铂＋Z–LEHD–FMK组细胞活力为：96.8%±3.6%、54.1%±5.8%和89.5%±5.1%。
结论p14ARF可通过p53非依赖Caspase–9依赖性途径增强顺铂诱导的骨肉瘤MG63细胞凋亡，该作用与内源性线粒体凋亡通路有关。