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摘要： 目的：探讨PD98059对缺糖缺氧再灌注损伤神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）细胞的保护作用 方法：将SH-SY5Y细胞随机分为正常组（Control组）、DMSO组、缺糖缺氧再灌注性损伤组（OGD/R组）、PD98059低剂量组（PD98059-L）、PD98059中剂量组（PD98059-M）、PD98059高剂量组（PD98059-H），DMSO组给予0.1%DMSO，PD98059-L、PD98059-M、PD98059-H分别给予10、30、50μmol/L的PD98059，24 h后OGD/R组、PD-L组、PD-M、PD-H组进行缺糖缺氧处理4 h，随后复氧24 h。采用CCK-8法测算细胞存活率; Western blotting法检测细胞中Caspase-3蛋白。结果 PD98059-L组、PD98059-M组、PD98059-H组细胞存活率高于OGD/R组（P均<0.05），逐渐增加。OGD/R组Caspase3相对表达量高于Control组、DMSO组，PD98059-L组、PD98059-M组、PD98059-H组Caspase3相对表达量低于OGD/R组（P均<0.05）。Caspase3相对表达量逐渐降低，两两比较，P均<0.05。结论 PD98059可保护缺糖缺氧再灌注损伤的SY-SY5Y细胞，提高细胞存活率，降低细胞凋亡率。
关键词：PD98059;缺糖缺氧再灌注损伤;SH-SY5Y细胞
【中图分类号】R73 【文献标识码】A 【文章编号】2107-2306（2020）02-311-01
脑卒中是人类神经系统残疾的主要原因，发病人群已经出现年轻化趋势，严重影响人民的身体健康和生活质量，给患者和社会照成了沉重的经济负担。脑卒中治疗原则是恢复缺血区域的血液供应。 目前对其急性治疗的治疗方法仅依靠通过药理溶栓和/或机械血栓切除术恢复血流[1]。 然而，它可以加重缺血后脑组织的损伤。 因此，迫切需要开发出疗效高，副作用少的新型药物来治疗中风和保护神经元[2]。细胞外信号调节激酶（ERK）为丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的成员之一，可被氧自由基激活，介导细胞凋亡[3]。ERK抑制剂PD98059则可保护神经细胞免受细胞氧化应激引起的细胞凋亡[4]。本实验以神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y为研究对象，在体外构建OGD/R模型以模拟脑缺血缺氧再灌性损伤模型，观察PD98059对OGD/R的SH-SY5Y细胞存活率、凋亡蛋白Caspase-3表达的影响。
1 材料与方法
1.2 OGD处理时间筛选 SH-SY5Y细胞在镜下观察至70%融合时，制成细胞悬液，种植于96孔板内，每组设置3个复孔，培养24h后，加入无糖DMEM， 将培养板至于三气培养箱（94%N2、5%CO2、1%O2）培养2.0、4.0、6.0 h。处理完后换成完全培养基，在正常培养箱中培养24 h，每孔加入10 μL的CCK-8溶液后培养3 h，用酶标仪检测OD值。实验重复3次。OGD处理2.0、4.0、6.0 h后细胞存活率分别为89.03%±3.99%、55.65%±1.95%、34.54%±2.78%。选取细胞存活率在50%～60%的作用时间段即OGD 4h作为后续实验条件[5]。
1.3 细胞分组、模型制作及PD98059干预 SH-SY5Y细胞复苏后接种于含5%胎牛血清的高糖MEM中，于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，细胞重悬铺板，取对数生长期细胞做实验。取良好的SH-SY5Y细胞，随机分为正常对照组（Control组）、DMSO组（DMSO组）、模型组（OGD/R组）、PD98059低剂量组（PD98059-L组）、PD98059中剂量组（PD98059-M组）、PD98059高剂量组（PD98059-H组）。Control组和OGD/R组加入完全培养基，DMSO组加入含0.1% DMSO的培养基，PD98059-L组、PD98059-M组、PD98059-H组分别加入终浓度为10、20、30 μmol/L的培养基。培养24 h后，Control组和DMSO组加入正常培养基，常规培养。OGD/R组、PD98059-L组、PD98059-M组、PD98059-H组换成无糖培养基，OGD处理2 h后，换成正常培養基，在培养箱中培养24 h。
1.4 细胞存活率测量 按照CCK-8检测试剂盒说明书检测各组细胞培养液中细胞存活率。
1.5 Caspase3蛋白检测 收集各组细胞，按照蛋白提取试剂盒、BCA试剂盒提取蛋白并检测蛋白浓度。每个样本加样量为100 μg;用Western blotting法检测Caspase3蛋白相对表达量。
1.6 统计学方法 数据采用SPSS19.0统计软件分析，各组数据以平均数±标准差表示，各组间采用单因素方差分析（ANOVA）， 以P<0.05为差异有统计学意义。 2 結果
2.1 各组存活率比较 Control组、DMSO组、OGD/R组、PD98059-L组、PD98059-M组、PD98059-H组细胞存活率分别为100%、94.65%±4.62%、54.25%±3.57%、64.72%±4.63%、76.28%±4.62%、88.72%±6.91%。PD98059-L组、PD98059-M组、PD98059-H组细胞存活率逐渐增加，两两相比，P均<0.05，有统计学意义。
2.2各组细胞中Caspase-3蛋白表达情况
Control组、DMSO组、OGD/R组、PD98059-L组、PD98059-M组、PD98059-H组细胞中Caspase3表达量分别为0.20±0.21、0.21±0.02、0.37±0.06、0.31±0.05、0.26±0.06、0.22±0.05。OGD/R组Caspase3相对表达量高于Control组、DMSO组（P均<0.05）;PD98059-L组、PD98059-M组、PD98059-H组Caspase3表达量低于OGD/R组，且表达量降低，两两比较，P均<0.05，有统计学意义。
3讨论
脑卒中具有高病死率和高致残率，且逐渐呈现年轻化趋势。本研究初步探明了ERK抑制剂PD98059对SH-SY5Y细胞缺糖缺氧再灌注性损伤后的凋亡具有明显的抗凋亡作用。具体机制还有待于更多的实验进行探索。
参考文献：
[1] Mar Martinez-Vila E， Irimia P： Challenges of neuroprotection and neurorestoration in ischemic stroke treatment. Cerebrovasc Dis 2018;20：148-158.
[2] Jaffer H， Morris VB， Stewart D， Labhasetwar V： Advances in stroke therapy. Drug Deliv Transl Res 2019;1：409-419.
[3] Lu TH， Tseng TJ， Su CC， et al. Arsenic induces reactive oxygen species-caused neuronal cell apoptosis through JNK/ERK-mediated mitochondria-dependent and GRP 78/CHOP-regulated pathways[J]. Toxicol Lett， 2014，224（1）：130-140.
关键词：PD98059;缺糖缺氧再灌注损伤;SH-SY5Y细胞
【中图分类号】R73 【文献标识码】A 【文章编号】2107-2306（2020）02-311-01
脑卒中是人类神经系统残疾的主要原因，发病人群已经出现年轻化趋势，严重影响人民的身体健康和生活质量，给患者和社会照成了沉重的经济负担。脑卒中治疗原则是恢复缺血区域的血液供应。 目前对其急性治疗的治疗方法仅依靠通过药理溶栓和/或机械血栓切除术恢复血流[1]。 然而，它可以加重缺血后脑组织的损伤。 因此，迫切需要开发出疗效高，副作用少的新型药物来治疗中风和保护神经元[2]。细胞外信号调节激酶（ERK）为丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的成员之一，可被氧自由基激活，介导细胞凋亡[3]。ERK抑制剂PD98059则可保护神经细胞免受细胞氧化应激引起的细胞凋亡[4]。本实验以神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y为研究对象，在体外构建OGD/R模型以模拟脑缺血缺氧再灌性损伤模型，观察PD98059对OGD/R的SH-SY5Y细胞存活率、凋亡蛋白Caspase-3表达的影响。
1 材料与方法
- 细胞与主要实验材料 SH-SY5Y细胞株购自武汉大学细胞库。MEM培养基、胎牛血清和L-谷氨酰胺购自Gibco公司。CCK-8、DMSO为美国Sigma公司产品。PD98059购自美国Selleck公司。一抗（Caspase-3 Rabbit mAb）购自Cell Signaling Technology公司。酶标仪购自美国Thermo Fisher Scientific公司。
1.2 OGD处理时间筛选 SH-SY5Y细胞在镜下观察至70%融合时，制成细胞悬液，种植于96孔板内，每组设置3个复孔，培养24h后，加入无糖DMEM， 将培养板至于三气培养箱（94%N2、5%CO2、1%O2）培养2.0、4.0、6.0 h。处理完后换成完全培养基，在正常培养箱中培养24 h，每孔加入10 μL的CCK-8溶液后培养3 h，用酶标仪检测OD值。实验重复3次。OGD处理2.0、4.0、6.0 h后细胞存活率分别为89.03%±3.99%、55.65%±1.95%、34.54%±2.78%。选取细胞存活率在50%～60%的作用时间段即OGD 4h作为后续实验条件[5]。
1.3 细胞分组、模型制作及PD98059干预 SH-SY5Y细胞复苏后接种于含5%胎牛血清的高糖MEM中，于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，细胞重悬铺板，取对数生长期细胞做实验。取良好的SH-SY5Y细胞，随机分为正常对照组（Control组）、DMSO组（DMSO组）、模型组（OGD/R组）、PD98059低剂量组（PD98059-L组）、PD98059中剂量组（PD98059-M组）、PD98059高剂量组（PD98059-H组）。Control组和OGD/R组加入完全培养基，DMSO组加入含0.1% DMSO的培养基，PD98059-L组、PD98059-M组、PD98059-H组分别加入终浓度为10、20、30 μmol/L的培养基。培养24 h后，Control组和DMSO组加入正常培养基，常规培养。OGD/R组、PD98059-L组、PD98059-M组、PD98059-H组换成无糖培养基，OGD处理2 h后，换成正常培養基，在培养箱中培养24 h。
1.4 细胞存活率测量 按照CCK-8检测试剂盒说明书检测各组细胞培养液中细胞存活率。
1.5 Caspase3蛋白检测 收集各组细胞，按照蛋白提取试剂盒、BCA试剂盒提取蛋白并检测蛋白浓度。每个样本加样量为100 μg;用Western blotting法检测Caspase3蛋白相对表达量。
1.6 统计学方法 数据采用SPSS19.0统计软件分析，各组数据以平均数±标准差表示，各组间采用单因素方差分析（ANOVA）， 以P<0.05为差异有统计学意义。 2 結果
2.1 各组存活率比较 Control组、DMSO组、OGD/R组、PD98059-L组、PD98059-M组、PD98059-H组细胞存活率分别为100%、94.65%±4.62%、54.25%±3.57%、64.72%±4.63%、76.28%±4.62%、88.72%±6.91%。PD98059-L组、PD98059-M组、PD98059-H组细胞存活率逐渐增加，两两相比，P均<0.05，有统计学意义。
2.2各组细胞中Caspase-3蛋白表达情况
Control组、DMSO组、OGD/R组、PD98059-L组、PD98059-M组、PD98059-H组细胞中Caspase3表达量分别为0.20±0.21、0.21±0.02、0.37±0.06、0.31±0.05、0.26±0.06、0.22±0.05。OGD/R组Caspase3相对表达量高于Control组、DMSO组（P均<0.05）;PD98059-L组、PD98059-M组、PD98059-H组Caspase3表达量低于OGD/R组，且表达量降低，两两比较，P均<0.05，有统计学意义。
3讨论
脑卒中具有高病死率和高致残率，且逐渐呈现年轻化趋势。本研究初步探明了ERK抑制剂PD98059对SH-SY5Y细胞缺糖缺氧再灌注性损伤后的凋亡具有明显的抗凋亡作用。具体机制还有待于更多的实验进行探索。
参考文献：
[1] Mar Martinez-Vila E， Irimia P： Challenges of neuroprotection and neurorestoration in ischemic stroke treatment. Cerebrovasc Dis 2018;20：148-158.
[2] Jaffer H， Morris VB， Stewart D， Labhasetwar V： Advances in stroke therapy. Drug Deliv Transl Res 2019;1：409-419.
[3] Lu TH， Tseng TJ， Su CC， et al. Arsenic induces reactive oxygen species-caused neuronal cell apoptosis through JNK/ERK-mediated mitochondria-dependent and GRP 78/CHOP-regulated pathways[J]. Toxicol Lett， 2014，224（1）：130-140.