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摘要：目的 观察加味当归贝母苦参丸对MFC胃癌荷瘤小鼠瘤组织Toll样受体（TLR2、TLR4、TLR6）、肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）和髓分化因子88（MyD88）表达的影响，探讨其相关的作用机制。方法 建立MFC胃癌荷瘤小鼠模型进行体内抗肿瘤试验。将筛选合格的48只MFC胃癌荷瘤小鼠随机分为模型组，阳性对照组（顺铂组），加味当归贝母苦参丸高剂量组（当高组）、低剂量组（当低组）和顺铂联合加味当归贝母苦参丸高剂量组（顺高组）、低剂量组（顺低组），各给药组給予相应药物灌胃，连续14 d，观察肿瘤生长情况及小鼠一般情况、肿瘤大体标本及HE染色后组织形态；RT-qPCR和免疫组化分别检测肿瘤组织TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88的表达。结果 模型组肿瘤细胞丰富，细胞大小不一、体积大、核大深染、异型明显，可见小灶性坏死，间质血管丰富；各给药组肿瘤细胞数量减少、排列疏松、细胞体积明显缩小、核固缩，细胞坏死明显增加，间质血管数量减少，胶原纤维增多，其中以顺低组、顺高组较为明显。与模型组比较，各给药组TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88 mRNA和蛋白表达均降低，顺低组、顺高组TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88蛋白着色变浅，呈弱阳性表达，较顺铂组、当高组、当低组蛋白改变更加明显。结论 加味当归贝母苦参丸可能通过下调荷瘤小鼠肿瘤组织TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88 mRNA和蛋白的表达，发挥抗肿瘤作用。
关键词：加味当归贝母苦参丸；胃癌；Toll样受体通路；小鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.08.013
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）08-0054-06
Effects of Modified Danggui Beimu Kushen Pills on Toll-like Receptor Pathway Markers on MFC Gastric Cancer Mice LI Hai-long1，2， WANG Yong1，2， ZHAI Yu1，2， CHENG Xiao-li3， AN Xia4， LI Hong-liang2， KANG Wan-rong2， WU Hong-yan2 （1. School of Clinical Medicine， Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 2. Key Laboratory of Traditional Chinese Herbs and Prescription Innovation and Transformation of Gansu Province， Key Laboratory of TCM Pharmacology and Toxicology in Gansu Province， Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 3. Teaching and Research Center， Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 4. Affiliated Hospital of Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730020， China）
Abstract： Objective To study the effects of modified Danggui Beimu Kushen Pills on the expressions of TLR2， TLR4， TLR6， TRAF6 and MyD88 in tumor tissues on MFC gastric cancer bearing mice； To discuss relevant mechanism of action. Methods MFC gastric cancer bearing mice were employed to perform anti-tumor experiment in vivo in this study. A total of eligible 48 mice were randomly divided into model group， DDP positive control group， modified Danggui Beimu Kushen Pills high-dose and low-dose groups， modified Danggui Beimu Kushen Pills high-dose and low-dose combined with DDP groups. The treatment was conducted once a day， and lasted for 14 continuous days. After the last administration of gavage orally treatment， all mice were anaesthetized and killed by
基金项目：甘肃省科技厅自然科学基金B类计划项目（1310RJZA099）；甘肃省中药药理与毒理学重点实验室开放基金项目（ZDSYS-KJ-2015-010）
通讯作者：吴红彦，E-mail：wu.hy@126.com
cervical dislocation method to obtain tumor tissue completely for further HE staining measure and detection of TLR2， TLR4， TLR6， TRAF6 and MyD88 in tumor tissue with the method of RT-qPCR and immunohistochemistry. Meanwhile， the tumor growth was observed and the general conditions of mice were recorded. Results The model group was rich in tumor cells； the sizes of cells were different； the volume was large； the nucleus was deeply stained and the heterotypic shape was obvious， and the small focal necrosis was seen. The number of tumor cells in each administration group was reduced； the arrangement was loose； the cell volume was significantly reduced， and the nuclear pyknosis was reduced. Cell necrosis significantly increased； the number of interstitial blood vessels decreased； collagen fibers increased， especially in modified Danggui Beimu Kushen Pills high-dose and low-dose combined with DDP groups. Compared with the model group， the expressions of TLR2， TLR4， TLR6， TRAF6 and MyD88 mRNA and protein decreased in each administration group. TLR2， TLR4， TLR6， TRAF6 and MyD88 were lighter and weakly positive expressed in modified Danggui Beimu Kushen Pillshigh-dose and low-dose combined with DDP groups， the protein changes were more obvious Compared with DDP positive control group， modified Danggui Beimu Kushen Pills high-dose and low-dose groups. Conclusion Modified Danggui Beimu Kushen Pills can down-regulate TLR2， TLR4， TLR6， TRAF6 and MyD88 expression of tumor tissue in MFC gastric cancer bearing mice at both mRNA and protein levels to play anti-tumor pharmacology action. Key words： modified Danggui Beimu Kushen Pills； gastric cancer； Toll-like receptor pathway； mice
胃癌是全球高发的恶性肿瘤之一，据国家癌症中心2015年统计，胃癌在我国恶性肿瘤死亡排名第3位[1]。体内外实验显示，当归贝母苦参丸干预胃癌和肝癌的药效明确[2-3]。当归贝母苦参丸出自《金匮要略》，原用于治疗妊娠小便困难。本实验以当归贝母苦参丸为基础方，增加黄芪、山慈菇、全蝎组成当归贝母苦参丸加味方。该方具有活血化瘀、化痰散结、解毒攻癌，兼顾调节机体补虚扶正、化生气血的功效。近年来研究发现，Toll样受体（TLRs）与炎症相关肿瘤发生发展密切相关[4]。TLRs是机体天然免疫系统中模式识别受体，可识别不同病原体相关分子模式（PAMPs），从而启动相关下游TLR4胞内信号通路，包括髓分化因子（MyD88）依赖和非依赖途径[5]。TLR4激活MyD88后，活化的MyD88聚集并结合IRAK1和IRAK2，然后作用于肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6），进一步激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子-κB（NF-κB）信号转导通路[6]。本研究采用RT-qPCR和免疫组化检测，探讨加味当归贝母苦参丸的抑瘤作用及对荷瘤鼠MFC胃癌组织TLR2、TLR4、TLR6和MyD88表达的影响，为其临床防治胃癌提供有效的科学依据。
1 材料与方法
1.1 动物
SPF级BALB/c-nu小鼠60只，雌、雄各半，体质量（20±2）g，北京维通利华实验动物技术有限公司。动物许可证号SCXK（京）2012-0001。饲养于室温20～25 ℃、湿度45%～55%环境，分笼饲养，自由摄食饮水。
1.2 细胞、药物及制备
MFC前胃癌细胞，中科院上海细胞库。加味当归贝母苦参丸（黄芪、当归、浙贝母、苦参、山慈菇、全蝎），饮片购自甘肃中医药大学附属医院，加10倍量水浸泡1 h，加热煮沸40 min，滤出煎液，药渣再加6倍量水加热煮沸40 min，合并2次煎液，70 ℃水浴蒸发浓缩至含1.0 g原药材/mL；顺铂注射液，江苏毫森药业股份有限公司，20 mg/支，批号20160522，将30 mg顺铂粉针加生理盐水，稀释为0.25 mg/mL，4 ℃冰箱保存备用。
1.3 主要试剂和仪器
胎牛血清（杭州四季青公司），反转录试剂盒DR036A（上海宝生物工程有限公司），扩增试剂盒（PREMEGO公司），二抗（中杉金桥公司），TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88一抗（IMMONOWAY公司）。生物安全柜、DMEM培养基（健顺生物公司），CO2培养箱（力康公司），倒置显微镜（日本OLYMPUS），ABI7500荧光PCR仪（美国ABI公司）。
2 实验方法
2.1 造模
将冻存细胞株取出，快速置于37 ℃水浴解冻，并转移细胞液于离心管中，加入适量培养液（高糖DMEM+10%胎牛血清），1000 r/min离心3 min，弃上清液，加入适量培养液重悬细胞，将细胞悬液接种入培养瓶，置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱培养，待细胞完全贴壁后，PBS清洗细胞3遍，更换培养液。1～2 d换液1次。每日倒置显微镜下观察，当细胞生长状态良好铺满瓶底时，25%胰酶常规方法消化、传代，待细胞长至对数生长期时传代，弃去培养基，将细胞制成悬液，浓度调整为15×106/mL，小鼠腋下接种胃癌MFC细胞，每只0.2 mL。
2.2 分组和给药
造模后观察肿瘤体积直径达0.5 cm时，剔除体积过大或过小小鼠，48只筛选合格小鼠随机分为模型组、阳性对照组（顺铂组）、加味当归贝母苦参丸高剂量（当高组）、加味当归贝母苦参丸低剂量组（当低组）和顺铂联合加味当归贝母苦参丸高剂量组（顺高组）、顺铂联合加味当归贝母苦参丸低剂量组（顺低组）。第2日开始，模型组小鼠予蒸馏水0.2 mL灌胃及腹腔注射生理盐水0.1 mL；当高组、当低组予中药0.2 mL灌胃，每日1次；顺铂组予蒸馏水0.2 mL灌胃及腹腔注射顺铂（25 mg/kg）0.1 mL，隔5 d给药1次，共3次；顺高组、顺低组予等量中药灌胃及腹腔注射顺铂（25 mg/kg）0.1 mL，共14 d。第15日18：00时禁食，不禁水。第16日处死小鼠取材备检。
2.3 肿瘤大体标本及组织形态观察
对荷瘤小鼠肿瘤组织进行剥离并进行肉眼观察，对肿瘤体积、颜色和质地进行记录，与此同时，需观察确定肿瘤组织假膜完整程度，是否存在出血状况等。随后4%多聚甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，切片，染色。对肿瘤组织和细胞形态进行镜检，实体瘤疗效以抑瘤率表示。抑瘤率（%）=（模型组平均瘤重-实验组平均瘤重）÷模型组平均瘤重×100%。
2.4 荧光定量PCR检测TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88 mRNA表达
称取30 mg肿瘤组织置于无RNA酶的EP管中匀浆，再加1 mL提取液静置5 min，常规低温抽提总RNA后溶解并检测其浓度，用Takara 036A反转录试剂盒反转录合成cDNA。使用ABI7500荧光定量PCR仪进行扩增。扩增条件：95 ℃、5 min预变性，95 ℃、10 s，60 ℃、20 s，40个循环，并分析融解曲线，确认扩增产物的特异性，相对表达量采用2-ΔΔCT法计算，实验重复3次，基因引物序列见表1。
2.5 免疫組化检测TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88蛋白表达
采用ABC法。切片常规脱蜡水化，3%去离子水灭活内源性酶10 min，微波修复抗原5 min，间隔重复1次；然后依次滴加TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88一抗及生物素化山羊抗兔二抗；滴加SABC，DAB显色，苏木素复染，梯度脱水透明后封片，显微镜下观察。以胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性。应用图像分析系统记录各自TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88积分光密度和平均灰度，作为蛋白表达的量化指标，每组各取材5个样本。 3 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，组间比较用方差分析，方差齐用LSD法，方差不齐用Dunnett'T3法。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 加味当归贝母苦参丸对MFC胃癌荷瘤小鼠瘤组织抑制率的影响
顺铂组小鼠体质量逐渐下降，精神差，进食减少，反应迟钝，当高组、顺高组状态较好，瘤质量较模型组差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结果见表2。
4.2 肿瘤大体标本及组织形态观察结果
模型组肿瘤细胞丰富，细胞大小不一、体积大、核大深染、异型明显，可见小灶性坏死，间质血管丰富；当低组肿瘤细胞丰富，细胞大小不一、体积相对缩小、核大深染，部分细胞核固缩，可见小灶性坏死、间质血管丰富，肿瘤细胞周围胶原纤维增多；当低组、当高组、顺铂组、顺低组、顺高组肿瘤细胞数减少、排列疏松，细胞体积缩小、核固缩，细胞坏死增加，间质血管数量减少，胶原纤维增多。结果见图1。
4.3 加味当归贝母苦参丸对荷瘤小鼠MFC胃癌瘤组织TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88 mRNA表达的影响
与模型组比较，各给药组TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88 mRNA表达均有不同程度变化，当高组、顺低组和顺高组变化较为明显。结果见表3。
4.4 加味当归贝母苦参丸对荷瘤小鼠MFC胃癌瘤组织TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88蛋白表达的影响
胞浆或胞膜出现黄色或棕黄色颗粒为阳性着色。与模型组比较，各给药组TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88蛋白着色较深，表明为强阳性或阳性表达，而模型组则呈现弱阳性或阴性表达。结果见表4、表5和图2～图6。
5 讨论
炎症可通过TLRs诱导内源性介质，促进肿瘤发生发展。TLRs高表达与肿瘤的增殖、侵袭转移密切相关，如陈战等[7]研究显示，胃癌组织中TLR4 mRNA和蛋白表达高于癌旁组织，其表达与胃癌分期、远处转移具有相关性，孙运良等[8]研究显示，TLR4可能参与了胃癌的发生和发展，有淋巴结转移者TLR4阳性率显著高于无淋巴结转移者，TNM分期为Ⅲ+Ⅳ期者TLR4蛋白表达率明显高于Ⅰ+Ⅱ期者，Spearman等级相关分析表明，TLR4蛋白表达与MVD呈显著正相关。Pimentel-Nunes P等[9]研究表明，TLR2与幽门螺杆菌感染及胃癌发生均相关。本课题组前期研究也发现，TLR2、TLR4、TLR6 mRNA在不同分化程度胃癌细胞中的表达相对于正常胃黏膜上皮GES-1细胞明显上调；不同浓度脂多糖干预胃癌SGC7901、BGC-823、MGC-803细胞后，TLR2、TLR4、TLR6表达也明显上调[10]。
刘鹏军等[11]研究显示，胃癌组织TRAF6阳性表达高于癌旁正常组织，其阳性表达与胃癌组织分化程度、TNM分期有关，可能参与胃癌的浸润及转移。Han F等[12]研究认为，TRAF6是预后不良的胃癌患者的预测。张金明等[13]研究显示，MyD88在食管癌组织中的阳性表达率为92.0%，明显高于癌旁组织中17.3%的阳性表达率；MyD88的阳性表达与临床分期和淋巴结转移呈正相关。唐乐辉等[14]研究显示，与癌旁正常组织相比，MyD88在乳腺癌组织中表达明显增高；MyD88的阳性表达与肿瘤的TNM分期、肿瘤大小、淋巴侵袭转移密切相关。厉鸥等[15]研究发现，MyD88蛋白在肝癌组织中的阳性表达高于癌旁组织，MyD88和STAT3表达与性别、分化程度、有无HBV感染和肝硬化有关。秦艳等[16]研究发现，MyD88蛋白表达与结直肠腺瘤及结直肠癌中腺瘤异型性相关。
Maeda Y等[17]研究表明，在炎症相关胃癌小鼠模型中，阻断MyD88的表达可以降低巨噬细胞中TLR2与COX-2/PGE2的表达，MyD88与COX-2/PGE2共同参与了肿瘤炎症微环境的产生，并通过诱导TLR2的表达促进肿瘤的发生发展。Obonyo M等[18]研究表明，幽门螺杆菌可以激活巨噬细胞中TLR2和TLR4的表达，TLR2激活MyD88通路对幽门螺杆菌诱导产生IL-6和IL-1β起到至关重要的作用。Kennedy C L等[19]报道，在gp130基因消减（F/F）小鼠胃癌模型中，TLR2可以促进肿瘤的增殖，而沉默MyD88基因可以抑制肿瘤的发生，其作用与促进胃癌上皮细胞凋亡和抑制其增殖有关。
本研究结果显示，加味当归贝母苦参丸方可使肿瘤组织瘤体缩小，抑瘤作用明显，并且与化疗药物联用后抗肿瘤作用更加明显。免疫组化研究显示，当归贝母苦参丸加味方可抑制肿瘤组织TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88 mRNA和蛋白的表达，并且与化疗药物联用后TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88 mRNA和蛋白下调表达更明显。另外，TLR2、TLR4、TLR6/MyD88通路及下游TRAF6炎证相关通路参与了胃癌发病机制，加味当归贝母苦参丸可调控该通路发挥抗肿瘤作用。值得注意的是，中药治疗引起的靶标分子转录层次的改变与蛋白层次的改变并不同步，蛋白层次的表达改变更加显著一些，这说明中药治療效应除经过基因转录外，表观遗传改变也可能起作用，这有待进一步深入研究。
综上所述，当归贝母苦参丸加味方对荷瘤小鼠MFC胃癌的抗瘤作用与下调TLRs通路分子TLR2、TLR4、TLR6、RAF6和MyD88 mRNA和蛋白的表达有关。
参考文献：
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（收稿日期：2016-11-06）
（修回日期：2016-12-25；編辑：华强）
关键词：加味当归贝母苦参丸；胃癌；Toll样受体通路；小鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.08.013
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）08-0054-06
Effects of Modified Danggui Beimu Kushen Pills on Toll-like Receptor Pathway Markers on MFC Gastric Cancer Mice LI Hai-long1，2， WANG Yong1，2， ZHAI Yu1，2， CHENG Xiao-li3， AN Xia4， LI Hong-liang2， KANG Wan-rong2， WU Hong-yan2 （1. School of Clinical Medicine， Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 2. Key Laboratory of Traditional Chinese Herbs and Prescription Innovation and Transformation of Gansu Province， Key Laboratory of TCM Pharmacology and Toxicology in Gansu Province， Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 3. Teaching and Research Center， Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 4. Affiliated Hospital of Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730020， China）
Abstract： Objective To study the effects of modified Danggui Beimu Kushen Pills on the expressions of TLR2， TLR4， TLR6， TRAF6 and MyD88 in tumor tissues on MFC gastric cancer bearing mice； To discuss relevant mechanism of action. Methods MFC gastric cancer bearing mice were employed to perform anti-tumor experiment in vivo in this study. A total of eligible 48 mice were randomly divided into model group， DDP positive control group， modified Danggui Beimu Kushen Pills high-dose and low-dose groups， modified Danggui Beimu Kushen Pills high-dose and low-dose combined with DDP groups. The treatment was conducted once a day， and lasted for 14 continuous days. After the last administration of gavage orally treatment， all mice were anaesthetized and killed by
基金项目：甘肃省科技厅自然科学基金B类计划项目（1310RJZA099）；甘肃省中药药理与毒理学重点实验室开放基金项目（ZDSYS-KJ-2015-010）
通讯作者：吴红彦，E-mail：wu.hy@126.com
cervical dislocation method to obtain tumor tissue completely for further HE staining measure and detection of TLR2， TLR4， TLR6， TRAF6 and MyD88 in tumor tissue with the method of RT-qPCR and immunohistochemistry. Meanwhile， the tumor growth was observed and the general conditions of mice were recorded. Results The model group was rich in tumor cells； the sizes of cells were different； the volume was large； the nucleus was deeply stained and the heterotypic shape was obvious， and the small focal necrosis was seen. The number of tumor cells in each administration group was reduced； the arrangement was loose； the cell volume was significantly reduced， and the nuclear pyknosis was reduced. Cell necrosis significantly increased； the number of interstitial blood vessels decreased； collagen fibers increased， especially in modified Danggui Beimu Kushen Pills high-dose and low-dose combined with DDP groups. Compared with the model group， the expressions of TLR2， TLR4， TLR6， TRAF6 and MyD88 mRNA and protein decreased in each administration group. TLR2， TLR4， TLR6， TRAF6 and MyD88 were lighter and weakly positive expressed in modified Danggui Beimu Kushen Pillshigh-dose and low-dose combined with DDP groups， the protein changes were more obvious Compared with DDP positive control group， modified Danggui Beimu Kushen Pills high-dose and low-dose groups. Conclusion Modified Danggui Beimu Kushen Pills can down-regulate TLR2， TLR4， TLR6， TRAF6 and MyD88 expression of tumor tissue in MFC gastric cancer bearing mice at both mRNA and protein levels to play anti-tumor pharmacology action. Key words： modified Danggui Beimu Kushen Pills； gastric cancer； Toll-like receptor pathway； mice
胃癌是全球高发的恶性肿瘤之一，据国家癌症中心2015年统计，胃癌在我国恶性肿瘤死亡排名第3位[1]。体内外实验显示，当归贝母苦参丸干预胃癌和肝癌的药效明确[2-3]。当归贝母苦参丸出自《金匮要略》，原用于治疗妊娠小便困难。本实验以当归贝母苦参丸为基础方，增加黄芪、山慈菇、全蝎组成当归贝母苦参丸加味方。该方具有活血化瘀、化痰散结、解毒攻癌，兼顾调节机体补虚扶正、化生气血的功效。近年来研究发现，Toll样受体（TLRs）与炎症相关肿瘤发生发展密切相关[4]。TLRs是机体天然免疫系统中模式识别受体，可识别不同病原体相关分子模式（PAMPs），从而启动相关下游TLR4胞内信号通路，包括髓分化因子（MyD88）依赖和非依赖途径[5]。TLR4激活MyD88后，活化的MyD88聚集并结合IRAK1和IRAK2，然后作用于肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6），进一步激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子-κB（NF-κB）信号转导通路[6]。本研究采用RT-qPCR和免疫组化检测，探讨加味当归贝母苦参丸的抑瘤作用及对荷瘤鼠MFC胃癌组织TLR2、TLR4、TLR6和MyD88表达的影响，为其临床防治胃癌提供有效的科学依据。
1 材料与方法
1.1 动物
SPF级BALB/c-nu小鼠60只，雌、雄各半，体质量（20±2）g，北京维通利华实验动物技术有限公司。动物许可证号SCXK（京）2012-0001。饲养于室温20～25 ℃、湿度45%～55%环境，分笼饲养，自由摄食饮水。
1.2 细胞、药物及制备
MFC前胃癌细胞，中科院上海细胞库。加味当归贝母苦参丸（黄芪、当归、浙贝母、苦参、山慈菇、全蝎），饮片购自甘肃中医药大学附属医院，加10倍量水浸泡1 h，加热煮沸40 min，滤出煎液，药渣再加6倍量水加热煮沸40 min，合并2次煎液，70 ℃水浴蒸发浓缩至含1.0 g原药材/mL；顺铂注射液，江苏毫森药业股份有限公司，20 mg/支，批号20160522，将30 mg顺铂粉针加生理盐水，稀释为0.25 mg/mL，4 ℃冰箱保存备用。
1.3 主要试剂和仪器
胎牛血清（杭州四季青公司），反转录试剂盒DR036A（上海宝生物工程有限公司），扩增试剂盒（PREMEGO公司），二抗（中杉金桥公司），TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88一抗（IMMONOWAY公司）。生物安全柜、DMEM培养基（健顺生物公司），CO2培养箱（力康公司），倒置显微镜（日本OLYMPUS），ABI7500荧光PCR仪（美国ABI公司）。
2 实验方法
2.1 造模
将冻存细胞株取出，快速置于37 ℃水浴解冻，并转移细胞液于离心管中，加入适量培养液（高糖DMEM+10%胎牛血清），1000 r/min离心3 min，弃上清液，加入适量培养液重悬细胞，将细胞悬液接种入培养瓶，置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱培养，待细胞完全贴壁后，PBS清洗细胞3遍，更换培养液。1～2 d换液1次。每日倒置显微镜下观察，当细胞生长状态良好铺满瓶底时，25%胰酶常规方法消化、传代，待细胞长至对数生长期时传代，弃去培养基，将细胞制成悬液，浓度调整为15×106/mL，小鼠腋下接种胃癌MFC细胞，每只0.2 mL。
2.2 分组和给药
造模后观察肿瘤体积直径达0.5 cm时，剔除体积过大或过小小鼠，48只筛选合格小鼠随机分为模型组、阳性对照组（顺铂组）、加味当归贝母苦参丸高剂量（当高组）、加味当归贝母苦参丸低剂量组（当低组）和顺铂联合加味当归贝母苦参丸高剂量组（顺高组）、顺铂联合加味当归贝母苦参丸低剂量组（顺低组）。第2日开始，模型组小鼠予蒸馏水0.2 mL灌胃及腹腔注射生理盐水0.1 mL；当高组、当低组予中药0.2 mL灌胃，每日1次；顺铂组予蒸馏水0.2 mL灌胃及腹腔注射顺铂（25 mg/kg）0.1 mL，隔5 d给药1次，共3次；顺高组、顺低组予等量中药灌胃及腹腔注射顺铂（25 mg/kg）0.1 mL，共14 d。第15日18：00时禁食，不禁水。第16日处死小鼠取材备检。
2.3 肿瘤大体标本及组织形态观察
对荷瘤小鼠肿瘤组织进行剥离并进行肉眼观察，对肿瘤体积、颜色和质地进行记录，与此同时，需观察确定肿瘤组织假膜完整程度，是否存在出血状况等。随后4%多聚甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，切片，染色。对肿瘤组织和细胞形态进行镜检，实体瘤疗效以抑瘤率表示。抑瘤率（%）=（模型组平均瘤重-实验组平均瘤重）÷模型组平均瘤重×100%。
2.4 荧光定量PCR检测TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88 mRNA表达
称取30 mg肿瘤组织置于无RNA酶的EP管中匀浆，再加1 mL提取液静置5 min，常规低温抽提总RNA后溶解并检测其浓度，用Takara 036A反转录试剂盒反转录合成cDNA。使用ABI7500荧光定量PCR仪进行扩增。扩增条件：95 ℃、5 min预变性，95 ℃、10 s，60 ℃、20 s，40个循环，并分析融解曲线，确认扩增产物的特异性，相对表达量采用2-ΔΔCT法计算，实验重复3次，基因引物序列见表1。
2.5 免疫組化检测TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88蛋白表达
采用ABC法。切片常规脱蜡水化，3%去离子水灭活内源性酶10 min，微波修复抗原5 min，间隔重复1次；然后依次滴加TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88一抗及生物素化山羊抗兔二抗；滴加SABC，DAB显色，苏木素复染，梯度脱水透明后封片，显微镜下观察。以胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性。应用图像分析系统记录各自TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88积分光密度和平均灰度，作为蛋白表达的量化指标，每组各取材5个样本。 3 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，组间比较用方差分析，方差齐用LSD法，方差不齐用Dunnett'T3法。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 加味当归贝母苦参丸对MFC胃癌荷瘤小鼠瘤组织抑制率的影响
顺铂组小鼠体质量逐渐下降，精神差，进食减少，反应迟钝，当高组、顺高组状态较好，瘤质量较模型组差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结果见表2。
4.2 肿瘤大体标本及组织形态观察结果
模型组肿瘤细胞丰富，细胞大小不一、体积大、核大深染、异型明显，可见小灶性坏死，间质血管丰富；当低组肿瘤细胞丰富，细胞大小不一、体积相对缩小、核大深染，部分细胞核固缩，可见小灶性坏死、间质血管丰富，肿瘤细胞周围胶原纤维增多；当低组、当高组、顺铂组、顺低组、顺高组肿瘤细胞数减少、排列疏松，细胞体积缩小、核固缩，细胞坏死增加，间质血管数量减少，胶原纤维增多。结果见图1。
4.3 加味当归贝母苦参丸对荷瘤小鼠MFC胃癌瘤组织TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88 mRNA表达的影响
与模型组比较，各给药组TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88 mRNA表达均有不同程度变化，当高组、顺低组和顺高组变化较为明显。结果见表3。
4.4 加味当归贝母苦参丸对荷瘤小鼠MFC胃癌瘤组织TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88蛋白表达的影响
胞浆或胞膜出现黄色或棕黄色颗粒为阳性着色。与模型组比较，各给药组TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88蛋白着色较深，表明为强阳性或阳性表达，而模型组则呈现弱阳性或阴性表达。结果见表4、表5和图2～图6。
5 讨论
炎症可通过TLRs诱导内源性介质，促进肿瘤发生发展。TLRs高表达与肿瘤的增殖、侵袭转移密切相关，如陈战等[7]研究显示，胃癌组织中TLR4 mRNA和蛋白表达高于癌旁组织，其表达与胃癌分期、远处转移具有相关性，孙运良等[8]研究显示，TLR4可能参与了胃癌的发生和发展，有淋巴结转移者TLR4阳性率显著高于无淋巴结转移者，TNM分期为Ⅲ+Ⅳ期者TLR4蛋白表达率明显高于Ⅰ+Ⅱ期者，Spearman等级相关分析表明，TLR4蛋白表达与MVD呈显著正相关。Pimentel-Nunes P等[9]研究表明，TLR2与幽门螺杆菌感染及胃癌发生均相关。本课题组前期研究也发现，TLR2、TLR4、TLR6 mRNA在不同分化程度胃癌细胞中的表达相对于正常胃黏膜上皮GES-1细胞明显上调；不同浓度脂多糖干预胃癌SGC7901、BGC-823、MGC-803细胞后，TLR2、TLR4、TLR6表达也明显上调[10]。
刘鹏军等[11]研究显示，胃癌组织TRAF6阳性表达高于癌旁正常组织，其阳性表达与胃癌组织分化程度、TNM分期有关，可能参与胃癌的浸润及转移。Han F等[12]研究认为，TRAF6是预后不良的胃癌患者的预测。张金明等[13]研究显示，MyD88在食管癌组织中的阳性表达率为92.0%，明显高于癌旁组织中17.3%的阳性表达率；MyD88的阳性表达与临床分期和淋巴结转移呈正相关。唐乐辉等[14]研究显示，与癌旁正常组织相比，MyD88在乳腺癌组织中表达明显增高；MyD88的阳性表达与肿瘤的TNM分期、肿瘤大小、淋巴侵袭转移密切相关。厉鸥等[15]研究发现，MyD88蛋白在肝癌组织中的阳性表达高于癌旁组织，MyD88和STAT3表达与性别、分化程度、有无HBV感染和肝硬化有关。秦艳等[16]研究发现，MyD88蛋白表达与结直肠腺瘤及结直肠癌中腺瘤异型性相关。
Maeda Y等[17]研究表明，在炎症相关胃癌小鼠模型中，阻断MyD88的表达可以降低巨噬细胞中TLR2与COX-2/PGE2的表达，MyD88与COX-2/PGE2共同参与了肿瘤炎症微环境的产生，并通过诱导TLR2的表达促进肿瘤的发生发展。Obonyo M等[18]研究表明，幽门螺杆菌可以激活巨噬细胞中TLR2和TLR4的表达，TLR2激活MyD88通路对幽门螺杆菌诱导产生IL-6和IL-1β起到至关重要的作用。Kennedy C L等[19]报道，在gp130基因消减（F/F）小鼠胃癌模型中，TLR2可以促进肿瘤的增殖，而沉默MyD88基因可以抑制肿瘤的发生，其作用与促进胃癌上皮细胞凋亡和抑制其增殖有关。
本研究结果显示，加味当归贝母苦参丸方可使肿瘤组织瘤体缩小，抑瘤作用明显，并且与化疗药物联用后抗肿瘤作用更加明显。免疫组化研究显示，当归贝母苦参丸加味方可抑制肿瘤组织TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88 mRNA和蛋白的表达，并且与化疗药物联用后TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88 mRNA和蛋白下调表达更明显。另外，TLR2、TLR4、TLR6/MyD88通路及下游TRAF6炎证相关通路参与了胃癌发病机制，加味当归贝母苦参丸可调控该通路发挥抗肿瘤作用。值得注意的是，中药治疗引起的靶标分子转录层次的改变与蛋白层次的改变并不同步，蛋白层次的表达改变更加显著一些，这说明中药治療效应除经过基因转录外，表观遗传改变也可能起作用，这有待进一步深入研究。
综上所述，当归贝母苦参丸加味方对荷瘤小鼠MFC胃癌的抗瘤作用与下调TLRs通路分子TLR2、TLR4、TLR6、RAF6和MyD88 mRNA和蛋白的表达有关。
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（收稿日期：2016-11-06）
（修回日期：2016-12-25；編辑：华强）