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摘要目的：探讨痰标本在细菌学检验中的应用价值。方法：选择送检于检验科的300例痰标本，分别接种培养于不同的培养基上。结果：1例标本在923TBL液体培养基浑浊，有细菌生长，在7H9L半固体蔗糖培养基中有油煎蛋样的菌落出现，而在罗氏培养基、923TBB和7119B培养基中没有菌落生长。结论：用高渗半固体培养基可以从临床痰标本中分离出结核分枝杆菌L型菌株，表明痰标本在细菌学检验中仍有一定的价值。
关键词痰标本细菌学检验
在感染疾病的病原菌中，细菌L型是细菌细胞壁部分缺损或完全丧失而造成的，细菌胞壁的缺失可以是自发的，也可以是人工诱导的，但人工诱导的频率远比自发为高。痰标本在琼脂培养基上，菌落呈“油煎蛋”样式[1]。本实验旨在筛查临床痰标本中结核分枝杆菌L型细菌的存在情况，论述了痰标本在细菌学检验中的应用效果，为进一步研究结核分枝杆菌L型细菌的形成提供思路，现报告如下。
资料与方法
实验对象：2009年6月～2012年5月送检于检验科的300例痰标本。
培养基配制：罗氏培养基的配制：基础液，谷氨酸钠1.8g、磷酸二氢钾1.2g，枸橼酸镁0.3g，葡萄糖0.3g，硫酸镁0.1g，丙三醇6ml、蒸馏水300ml。上述溶液加热充分溶解，加入土豆粉6g，摇匀加热5分钟。冷却到40～50℃时，加入500ml全卵液，加入已经高压灭菌的2%孔雀绿10ml，摇，静置后进行分装。呈斜面放置于干燥箱85℃，1.5小时。冷却后，培养基斜面颜色鲜艳，表面光滑无气泡，4℃保存。
痰标本的细菌培养：取痰标本，以1：3的比例加入消化液，漩涡振荡，3000转/分，离心15分钟，加入适量PBS重悬沉淀，取300ml分别接种于Middlebrook MGIT 7H9液体、7H9L、7H9B半同体培养基、923TBB和923TBL液体培养基中，37℃静置培养。消化液的配制：4%NaOH 50ml，2.9%枸橼酸钠50ml，N-乙酰-L-半胱氨酸0.5g当天配制，24小時内使用。染色涂片后光学显微镜下镜检。
结果
细菌培养结果：痰液经预处理后接种于Middlebrook MGIT 7H9液体、7H9L、7H9B半同体培养基、923TBB和923TBL液体培养基，培养结果显示1例标本在923TBL液体培养基浑浊，有细菌生长，在7H9L半固体蔗糖培养基中有油煎蛋样的菌落出现，而在罗氏培养基、923TBB和7119B培养基中没有菌落生长。
涂片镜检分析：1例标本菌株的煎蛋样菌落经抗酸染色可见大小不等的短杆状的细菌。
病历分析：患者，男，19岁，汉族。患者于2010年10月曾患“颈淋巴结核”抗痨治疗好转，2011年10月患者无诱因出现咳嗽，以干咳为主伴少量白色稀薄液，X线左肺上中野见斑片状阴影，边界模糊，CT左肺斑片状密度不均一影。入院检查：痰检三次均为阴性，医师根据影像学结核胸片病灶形态以临床症状，考虑为继发性肺结核。常规：粒细胞百分比71.7%（30～90），淋巴细胞绝对值1.3×109（2～10），入院后给予抗炎，抗痨支持治疗：INH 0.4g，1次/日，RFP 0.4g，1次/日，PZA 1.5g，1次/日，SM 0.759g，1次/日症状，缓解，无药物不良反应，痊愈后出院。
讨论
细菌细胞壁缺陷型（细菌L型），在某种情况下细胞壁肽聚糖结构可遭破坏，或当其合成受到抑制时，革兰阳性菌细胞壁几乎完全缺失，原生质仅被一层胞膜包绕，一般呈球形，称原生质体[2]。革兰阴性菌经溶菌酶处理后，因其细胞壁中肽聚糖含量较少，且可保留某些或全部的外膜保护，内部渗透压又比革兰阳性菌低，故形成一种对低渗环境具有一定抵抗力的圆球体，或称原生质球[3，4]。
痰是病理产物，主要是肺、支气管和气管内的炎性分泌物。咳嗽的患者采集痰标本，主要目的是为了检查，进行病原菌的鉴定，并有助于诊断和治疗。我们知道，肺结核患者痰中能否找到L型细菌，除痰中含菌量大小外，正确留取痰标本的方法是：在留痰之前先用清水漱口数次，以清除口腔内的食物残渣及部分杂菌。留取的痰应是用力咳嗽后自气管内咳出的痰，然后盛于痰盒内送检。不要将唾液或鼻涕吐入痰盒，以免影响查痰结果。初次就诊需查痰，医生要求送3个痰标本：即时痰：就诊当时咳出的痰；夜间痰：前1天晚间咳出的痰；清晨痰：起床后深咳吐出的痰，其中以清晨第1次咳出的痰效果最好[5]。应采集12～24小时内的痰液。测定24小时痰量或观察分层情况时，容器可加少量石炭酸防腐。用于细菌培养的标本，必须无菌采集，并先用无菌水漱口，以避免口腔内正常菌的污染。为了防止痰液污染，用过的标本应灭菌后再处理[6]。本文通过痰检验结果显示，本文1例患者是多次抗痨治疗，抗痨药物中异烟肼对细胞壁的合成有抑制作用，这给L型细菌的形成提供了条件，但是经过痰涂片抗酸染色没有发病病原菌，通过将痰液消化处理，接种于培养L型细菌的7H9高渗半固体发现了L型细菌。
总之，用高渗半固体培养基可以从临床痰标本中分离出结核分枝杆菌L型菌株，表明痰标本在细菌学检验中仍有一定的价值。
参考文献
1祝秉东，于红娟.结核病学基础与临床[M].兰州：兰州大学出版社，2009：369-375.
2中国防痨协会.结核病诊断细菌学检验规程[J].中国防痨杂志，2008，18（1）：28-31.
3Chiodini RJ，Van Kruiningen HJ，Thayer WR，et al.Spheroplastic phase of mycobacteria isolated from patients with Crohn’S disease.J Clin Microbiol，2009，24（3）：357-363.
4朱明利，张永乐，张立诚，等.肺结核患者结核菌L型感染及其荧光定量PCR检测的意义[J].中国实验诊断学，2008，12（5）：632-635.
5卢润生，蒋绍双，李定越.结核菌L型培养基的改进[J].四川医学，2004，25（7）：735-736.
6朱明利，张元和，李明君，等.肺结核、肺癌患者外周血结核分枝杆菌及其1型的检测方法[J].蚌埠医学院学报，2011，26（1）：71-73.
关键词痰标本细菌学检验
在感染疾病的病原菌中，细菌L型是细菌细胞壁部分缺损或完全丧失而造成的，细菌胞壁的缺失可以是自发的，也可以是人工诱导的，但人工诱导的频率远比自发为高。痰标本在琼脂培养基上，菌落呈“油煎蛋”样式[1]。本实验旨在筛查临床痰标本中结核分枝杆菌L型细菌的存在情况，论述了痰标本在细菌学检验中的应用效果，为进一步研究结核分枝杆菌L型细菌的形成提供思路，现报告如下。
资料与方法
实验对象：2009年6月～2012年5月送检于检验科的300例痰标本。
培养基配制：罗氏培养基的配制：基础液，谷氨酸钠1.8g、磷酸二氢钾1.2g，枸橼酸镁0.3g，葡萄糖0.3g，硫酸镁0.1g，丙三醇6ml、蒸馏水300ml。上述溶液加热充分溶解，加入土豆粉6g，摇匀加热5分钟。冷却到40～50℃时，加入500ml全卵液，加入已经高压灭菌的2%孔雀绿10ml，摇，静置后进行分装。呈斜面放置于干燥箱85℃，1.5小时。冷却后，培养基斜面颜色鲜艳，表面光滑无气泡，4℃保存。
痰标本的细菌培养：取痰标本，以1：3的比例加入消化液，漩涡振荡，3000转/分，离心15分钟，加入适量PBS重悬沉淀，取300ml分别接种于Middlebrook MGIT 7H9液体、7H9L、7H9B半同体培养基、923TBB和923TBL液体培养基中，37℃静置培养。消化液的配制：4%NaOH 50ml，2.9%枸橼酸钠50ml，N-乙酰-L-半胱氨酸0.5g当天配制，24小時内使用。染色涂片后光学显微镜下镜检。
结果
细菌培养结果：痰液经预处理后接种于Middlebrook MGIT 7H9液体、7H9L、7H9B半同体培养基、923TBB和923TBL液体培养基，培养结果显示1例标本在923TBL液体培养基浑浊，有细菌生长，在7H9L半固体蔗糖培养基中有油煎蛋样的菌落出现，而在罗氏培养基、923TBB和7119B培养基中没有菌落生长。
涂片镜检分析：1例标本菌株的煎蛋样菌落经抗酸染色可见大小不等的短杆状的细菌。
病历分析：患者，男，19岁，汉族。患者于2010年10月曾患“颈淋巴结核”抗痨治疗好转，2011年10月患者无诱因出现咳嗽，以干咳为主伴少量白色稀薄液，X线左肺上中野见斑片状阴影，边界模糊，CT左肺斑片状密度不均一影。入院检查：痰检三次均为阴性，医师根据影像学结核胸片病灶形态以临床症状，考虑为继发性肺结核。常规：粒细胞百分比71.7%（30～90），淋巴细胞绝对值1.3×109（2～10），入院后给予抗炎，抗痨支持治疗：INH 0.4g，1次/日，RFP 0.4g，1次/日，PZA 1.5g，1次/日，SM 0.759g，1次/日症状，缓解，无药物不良反应，痊愈后出院。
讨论
细菌细胞壁缺陷型（细菌L型），在某种情况下细胞壁肽聚糖结构可遭破坏，或当其合成受到抑制时，革兰阳性菌细胞壁几乎完全缺失，原生质仅被一层胞膜包绕，一般呈球形，称原生质体[2]。革兰阴性菌经溶菌酶处理后，因其细胞壁中肽聚糖含量较少，且可保留某些或全部的外膜保护，内部渗透压又比革兰阳性菌低，故形成一种对低渗环境具有一定抵抗力的圆球体，或称原生质球[3，4]。
痰是病理产物，主要是肺、支气管和气管内的炎性分泌物。咳嗽的患者采集痰标本，主要目的是为了检查，进行病原菌的鉴定，并有助于诊断和治疗。我们知道，肺结核患者痰中能否找到L型细菌，除痰中含菌量大小外，正确留取痰标本的方法是：在留痰之前先用清水漱口数次，以清除口腔内的食物残渣及部分杂菌。留取的痰应是用力咳嗽后自气管内咳出的痰，然后盛于痰盒内送检。不要将唾液或鼻涕吐入痰盒，以免影响查痰结果。初次就诊需查痰，医生要求送3个痰标本：即时痰：就诊当时咳出的痰；夜间痰：前1天晚间咳出的痰；清晨痰：起床后深咳吐出的痰，其中以清晨第1次咳出的痰效果最好[5]。应采集12～24小时内的痰液。测定24小时痰量或观察分层情况时，容器可加少量石炭酸防腐。用于细菌培养的标本，必须无菌采集，并先用无菌水漱口，以避免口腔内正常菌的污染。为了防止痰液污染，用过的标本应灭菌后再处理[6]。本文通过痰检验结果显示，本文1例患者是多次抗痨治疗，抗痨药物中异烟肼对细胞壁的合成有抑制作用，这给L型细菌的形成提供了条件，但是经过痰涂片抗酸染色没有发病病原菌，通过将痰液消化处理，接种于培养L型细菌的7H9高渗半固体发现了L型细菌。
总之，用高渗半固体培养基可以从临床痰标本中分离出结核分枝杆菌L型菌株，表明痰标本在细菌学检验中仍有一定的价值。
参考文献
1祝秉东，于红娟.结核病学基础与临床[M].兰州：兰州大学出版社，2009：369-375.
2中国防痨协会.结核病诊断细菌学检验规程[J].中国防痨杂志，2008，18（1）：28-31.
3Chiodini RJ，Van Kruiningen HJ，Thayer WR，et al.Spheroplastic phase of mycobacteria isolated from patients with Crohn’S disease.J Clin Microbiol，2009，24（3）：357-363.
4朱明利，张永乐，张立诚，等.肺结核患者结核菌L型感染及其荧光定量PCR检测的意义[J].中国实验诊断学，2008，12（5）：632-635.
5卢润生，蒋绍双，李定越.结核菌L型培养基的改进[J].四川医学，2004，25（7）：735-736.
6朱明利，张元和，李明君，等.肺结核、肺癌患者外周血结核分枝杆菌及其1型的检测方法[J].蚌埠医学院学报，2011，26（1）：71-73.