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【摘 要】目的：探讨慢性愤怒应激对大鼠脑老化进程及血浆儿茶酚胺水平的影响。方法：在D-半乳糖（D-gal）衰老及脑老化模型基础上引入愤怒刺激，用Morris水迷宫实验观察慢性愤怒应激对大鼠空间学习记忆能力的影响，并测定血浆中儿茶酚胺肾上腺素（E）、去甲肾上腺素（NE）、多巴胺（DA）的含量。结果：与模型组比较，愤怒应激组大鼠空间学习记忆能力明显下降，血浆E、NE、DA均显著升高。结论：慢性愤怒应激加重D-gal大鼠脑老化程度，加速衰老进程；血浆儿茶酚胺含量升高可能是其发生的机制之一。
【关键词】愤怒应激；脑老化；儿茶酚胺
随着生活节奏加快，社会竞争日益激烈，越来越多的人们感受到社会生活更为紧张，由此引发的情绪与心理问题日益增多。愤怒是负性情绪的核心[1]，与健康和疾病的关系极为密切，有国外学者指出[2]，具有愤怒倾向的人群更易出现健康问题。中医认为，肝主疏泄，在志为怒，怒伤肝，长期或剧烈的愤怒情绪会阻碍肝疏泄气机的功能，使气机逆乱。头为诸阳之会，五脏精华之血，六腑清阳之气皆汇聚于脑，方有神明之用，若气机逆乱，气血不能正常输布于脑，脑失濡养日久则可能导致脑老化加速。那么，愤怒情志对脑老化进程究竟有何影响？其机制如何？本研究借助动物实验探讨慢性愤怒应激对大鼠脑老化进程的影响及其部分神经内分泌机制。
1 材料与方法
1.1 动物及分组 Wistar雄性大鼠56只，SPF级3月龄，购于北京维通利华实验动物技术有限公司（SCXK（京）2006-0009），体重为360±10g。在河南省食品药品检验所动物实验中心屏障环境设施动物实验室（SYXK（豫）2005-0011）进行实验，并由该实验室提供标准实验动物灭菌饲料。正常饲养3日后，按体重随机分为空白对照组、D-gal衰老及脑老化模型组（简称模型组）、慢性愤怒应激组（简称愤怒应激组）三组，每组14只，其余14只作为攻击鼠。各组分笼饲养，自由饮食饮水。（注：模型组予以注射D-gal，愤怒应激组在注射D-gal基础上引入愤怒刺激。）
1.2 主要试剂及仪器 大鼠血浆E酶免试剂盒（美国R&D公司，批号：09-05）；大鼠血浆NE酶免试剂盒（美国R&D公司，批号：09-05）；大鼠血浆DA酶免试剂盒（美国R&D公司，批号：09-05）；680自动酶标分析仪（美国伯乐）；1575自动酶标洗板机（美国伯乐）；HPS-250生化培养箱（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）；Morris水迷宫（成都泰盟科技有限公司）。
1.3 D-gal衰老模型 参考李文彬等[3] D-gal衰老及脑老化造模方法，模型组和愤怒应激组注射D-gal溶液，制作衰老及脑老化模型。具体方法：将D-gal溶于生理盐水，浓度为2%，注射容量为0.01ml？g-1，每日1次，颈后部皮下注射，空白对照组注射同体积生理盐水，连续6周。每周测体重1次，依所测体重计算注射容量。
1.4 愤怒应激组引入愤怒刺激的方法 课题组在夹尾间接激怒法[3]基础上，受传统直接电击法的启发，创立一种新型诱发大鼠愤怒情绪的方法——间接电击激怒法。自实验第三周始每天下午3点对愤怒应激组大鼠进行愤怒刺激。具体方法：使用特制电刺激仪作为电刺激工具，把愤怒应激组大鼠单独放入特制金属笼内，再随机放进一只攻击鼠，用一端电极触碰攻击鼠前部（电极的另一端与金属笼相连以构成回路），攻击鼠受电击被激惹，对愤怒应激组大鼠发起攻击，双方互相撕咬、对峙，产生愤怒心理和行为。频率为1～2次/min，每天刺激15min，连续4周。最后攻击鼠丢弃不用。
1.5 标本采集及制备 实验至第37天始，进行Morris水迷宫测试，为期6天。至第42天完成实验后，禁食24小时，按每100g体重注射0.5～1.5ml 20%乌拉坦，麻醉后经腹主动脉取血4～5ml，静置、离心，吸取上清液，-70℃保存，用于测定血浆肾上腺素（epinephrine， E）、去甲肾上腺素（norepinephrine， NE）、多巴胺（dopamine， DA）。
1.6 统计学方法 实验结果用SPSS 13.0统计软件包进行处理。数值变量以 进行统计描述。数值变量组间均数差异的比较，正态分布和方差符合齐性
检验后，采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较用LSD法，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 慢性愤怒应激对D-gal大鼠空间学习记忆能力的影响表1显示的是Morris水迷宫第6天的测试结果：愤怒应激组较模型组大鼠寻台时间（searching platform latency， SPL）明显延长（P<0.05）。见表1。
2.2 慢性愤怒应激对D-gal大鼠血浆儿茶酚胺的影响 与模型组相比，愤怒应激组大鼠血浆E、NE、DA含量均明显升高（P<0.01）。见表1。
3 讨论
学习记忆能力减退是衰老尤其是脑老化的重要表现，临床上脑老化患者可呈现进行性精神状态衰变，包括远近期记忆力障碍、情绪改变、分析判断能力衰退、行为失常等。本研究用Morris水迷宫检测动物空间定位与学习记忆能力，结果显示：愤怒应激组较模型组SPL明显延长，提示持续的愤怒应激加重D-gal衰老大鼠空间学习能力减退的程度，加速大鼠脑老化进程。
E是由肾上腺髓质分泌的一种儿茶酚胺激素，在应激状态、内脏神经刺激和低血糖等情况下，释放入血液循环，促进糖原分解并升高血糖，促进脂肪分解，引起心跳加快。当人体经历某些刺激（如兴奋，恐惧，紧张等）时，分泌E，促使呼吸加快以提供大量氧气，同时引起心跳与血液流动加速，瞳孔放大，为身体活动提供更多能量，使反应更加快速。 NE属于神经递质，也是一种激素，循环血液中的NE主要来自肾上腺髓质。目前认为中枢的NE神经元与交感-肾上腺髓质系统是两个独立的系统，但在情绪活动加剧时，两者的活动都增强。NE系统适度兴奋可能产生兴奋和欣快的情绪，过度兴奋则可能导致躁狂和攻击行为，说明NE水平变化与情绪变化密切相关。血中E、NE水平，目前被公认为反映交感-肾上腺髓质功能状态的可靠指标。本实验结果显示：接受愤怒刺激的愤怒应激组大鼠血浆E、NE含量明显上升，可能是由于愤怒激活了交感-肾上腺髓质系统，导致大量的E、NE释放入血。
DA由脑内分泌，属于儿茶酚胺类，参与调节机体的觉醒、注意力和精神情绪状态。中枢内多巴胺系统主要参与对躯体运动、精神情绪活动、垂体内分泌功能以及心血管活动等的调节。在应激情况下，DA神经元生理活动加强，当应激的强度或持续时间超过机体耐受能力时，将导致认知功能及操作能力下降。酪氨酸的充足供应能增强DA的合成和释放，在一定程度上拮抗应激对中枢DA神经元的损害[4]。本研究中，模型组DA较空白对照组含量有下降趋势，提示衰老有阻碍DA合成，降低认知能力的倾向；愤怒应激组DA含量较模型组明显升高，提示愤怒情绪可引起血中DA含量增加。
三种儿茶酚胺E、NE、DA均可兴奋HPA轴功能，导致HPA轴亢进，进而引起血中促肾上腺皮质激素（adrenocorticotrophic hormone， ACTH）、糖皮质激素（cortisol， CORT）浓度上升。海马上糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor， GR）表达最高，血中高浓度的CORT极易与GR结合，引起GR损伤，进而导致海马组织受损[5-6]。海马是学习记忆的关键部位，海马损伤必将使大鼠学习记忆能力下降，加速脑老化进程。本研究中，长期愤怒应激使大鼠血浆E、NE、DA含量上升，且SPL明显延长，表明血浆儿茶酚胺水平升高，大鼠学习记忆能力下降，提示出现脑老化迹象。因此可以认为，愤怒情绪长期积累引起血浆儿茶酚胺含量升高，从而进一步激活HPA轴，亢进的HPA轴分泌大量CORT，损伤海马组织而加速脑老化进程。
参考文献
[1] 詹向红，刘胜利，江虹等. 愤怒情志表达方式及特质对自主神经的影响[J].中华中医药杂志.2011，26（7）：1475-1478.
[2] Williams JE， Johnson AM， Heiss G， et al. Association between exposure to combat-related stress and psychological health in aging men： the Atherosclerosis Risk in Communities （ARIC） Study[J]. J Trauma Stress. 2010，23（3）：358-366.
[3] 李文彬，韦丰，范明等.D-半乳糖在小鼠上诱导的拟脑老化效应[J].中国药理学与毒理学杂志. 1995，9（2）：93-95.
[4] 陈伟强，程义勇，李树田等.心理应激对大鼠旷场行为的影响及酪氨酸干预作用研究[J].中国应用生理学杂志.2009，25（1）：125-128.
[5] Mc Ewen BS， Magarinos AM. Stress effects on morphology and function of the hippocampus[J].Ann N Y Acad Sci，1997，821：271-284.[6] De Kloet ER， Vreugdenhil E， Oitzl MS， et al. Brain corticosteroid receptor， balance in health and disease [J]. Endocr Rev，1998，19（3）：269-301.
【关键词】愤怒应激；脑老化；儿茶酚胺
随着生活节奏加快，社会竞争日益激烈，越来越多的人们感受到社会生活更为紧张，由此引发的情绪与心理问题日益增多。愤怒是负性情绪的核心[1]，与健康和疾病的关系极为密切，有国外学者指出[2]，具有愤怒倾向的人群更易出现健康问题。中医认为，肝主疏泄，在志为怒，怒伤肝，长期或剧烈的愤怒情绪会阻碍肝疏泄气机的功能，使气机逆乱。头为诸阳之会，五脏精华之血，六腑清阳之气皆汇聚于脑，方有神明之用，若气机逆乱，气血不能正常输布于脑，脑失濡养日久则可能导致脑老化加速。那么，愤怒情志对脑老化进程究竟有何影响？其机制如何？本研究借助动物实验探讨慢性愤怒应激对大鼠脑老化进程的影响及其部分神经内分泌机制。
1 材料与方法
1.1 动物及分组 Wistar雄性大鼠56只，SPF级3月龄，购于北京维通利华实验动物技术有限公司（SCXK（京）2006-0009），体重为360±10g。在河南省食品药品检验所动物实验中心屏障环境设施动物实验室（SYXK（豫）2005-0011）进行实验，并由该实验室提供标准实验动物灭菌饲料。正常饲养3日后，按体重随机分为空白对照组、D-gal衰老及脑老化模型组（简称模型组）、慢性愤怒应激组（简称愤怒应激组）三组，每组14只，其余14只作为攻击鼠。各组分笼饲养，自由饮食饮水。（注：模型组予以注射D-gal，愤怒应激组在注射D-gal基础上引入愤怒刺激。）
1.2 主要试剂及仪器 大鼠血浆E酶免试剂盒（美国R&D公司，批号：09-05）；大鼠血浆NE酶免试剂盒（美国R&D公司，批号：09-05）；大鼠血浆DA酶免试剂盒（美国R&D公司，批号：09-05）；680自动酶标分析仪（美国伯乐）；1575自动酶标洗板机（美国伯乐）；HPS-250生化培养箱（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）；Morris水迷宫（成都泰盟科技有限公司）。
1.3 D-gal衰老模型 参考李文彬等[3] D-gal衰老及脑老化造模方法，模型组和愤怒应激组注射D-gal溶液，制作衰老及脑老化模型。具体方法：将D-gal溶于生理盐水，浓度为2%，注射容量为0.01ml？g-1，每日1次，颈后部皮下注射，空白对照组注射同体积生理盐水，连续6周。每周测体重1次，依所测体重计算注射容量。
1.4 愤怒应激组引入愤怒刺激的方法 课题组在夹尾间接激怒法[3]基础上，受传统直接电击法的启发，创立一种新型诱发大鼠愤怒情绪的方法——间接电击激怒法。自实验第三周始每天下午3点对愤怒应激组大鼠进行愤怒刺激。具体方法：使用特制电刺激仪作为电刺激工具，把愤怒应激组大鼠单独放入特制金属笼内，再随机放进一只攻击鼠，用一端电极触碰攻击鼠前部（电极的另一端与金属笼相连以构成回路），攻击鼠受电击被激惹，对愤怒应激组大鼠发起攻击，双方互相撕咬、对峙，产生愤怒心理和行为。频率为1～2次/min，每天刺激15min，连续4周。最后攻击鼠丢弃不用。
1.5 标本采集及制备 实验至第37天始，进行Morris水迷宫测试，为期6天。至第42天完成实验后，禁食24小时，按每100g体重注射0.5～1.5ml 20%乌拉坦，麻醉后经腹主动脉取血4～5ml，静置、离心，吸取上清液，-70℃保存，用于测定血浆肾上腺素（epinephrine， E）、去甲肾上腺素（norepinephrine， NE）、多巴胺（dopamine， DA）。
1.6 统计学方法 实验结果用SPSS 13.0统计软件包进行处理。数值变量以 进行统计描述。数值变量组间均数差异的比较，正态分布和方差符合齐性
检验后，采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较用LSD法，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 慢性愤怒应激对D-gal大鼠空间学习记忆能力的影响表1显示的是Morris水迷宫第6天的测试结果：愤怒应激组较模型组大鼠寻台时间（searching platform latency， SPL）明显延长（P<0.05）。见表1。
2.2 慢性愤怒应激对D-gal大鼠血浆儿茶酚胺的影响 与模型组相比，愤怒应激组大鼠血浆E、NE、DA含量均明显升高（P<0.01）。见表1。
3 讨论
学习记忆能力减退是衰老尤其是脑老化的重要表现，临床上脑老化患者可呈现进行性精神状态衰变，包括远近期记忆力障碍、情绪改变、分析判断能力衰退、行为失常等。本研究用Morris水迷宫检测动物空间定位与学习记忆能力，结果显示：愤怒应激组较模型组SPL明显延长，提示持续的愤怒应激加重D-gal衰老大鼠空间学习能力减退的程度，加速大鼠脑老化进程。
E是由肾上腺髓质分泌的一种儿茶酚胺激素，在应激状态、内脏神经刺激和低血糖等情况下，释放入血液循环，促进糖原分解并升高血糖，促进脂肪分解，引起心跳加快。当人体经历某些刺激（如兴奋，恐惧，紧张等）时，分泌E，促使呼吸加快以提供大量氧气，同时引起心跳与血液流动加速，瞳孔放大，为身体活动提供更多能量，使反应更加快速。 NE属于神经递质，也是一种激素，循环血液中的NE主要来自肾上腺髓质。目前认为中枢的NE神经元与交感-肾上腺髓质系统是两个独立的系统，但在情绪活动加剧时，两者的活动都增强。NE系统适度兴奋可能产生兴奋和欣快的情绪，过度兴奋则可能导致躁狂和攻击行为，说明NE水平变化与情绪变化密切相关。血中E、NE水平，目前被公认为反映交感-肾上腺髓质功能状态的可靠指标。本实验结果显示：接受愤怒刺激的愤怒应激组大鼠血浆E、NE含量明显上升，可能是由于愤怒激活了交感-肾上腺髓质系统，导致大量的E、NE释放入血。
DA由脑内分泌，属于儿茶酚胺类，参与调节机体的觉醒、注意力和精神情绪状态。中枢内多巴胺系统主要参与对躯体运动、精神情绪活动、垂体内分泌功能以及心血管活动等的调节。在应激情况下，DA神经元生理活动加强，当应激的强度或持续时间超过机体耐受能力时，将导致认知功能及操作能力下降。酪氨酸的充足供应能增强DA的合成和释放，在一定程度上拮抗应激对中枢DA神经元的损害[4]。本研究中，模型组DA较空白对照组含量有下降趋势，提示衰老有阻碍DA合成，降低认知能力的倾向；愤怒应激组DA含量较模型组明显升高，提示愤怒情绪可引起血中DA含量增加。
三种儿茶酚胺E、NE、DA均可兴奋HPA轴功能，导致HPA轴亢进，进而引起血中促肾上腺皮质激素（adrenocorticotrophic hormone， ACTH）、糖皮质激素（cortisol， CORT）浓度上升。海马上糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor， GR）表达最高，血中高浓度的CORT极易与GR结合，引起GR损伤，进而导致海马组织受损[5-6]。海马是学习记忆的关键部位，海马损伤必将使大鼠学习记忆能力下降，加速脑老化进程。本研究中，长期愤怒应激使大鼠血浆E、NE、DA含量上升，且SPL明显延长，表明血浆儿茶酚胺水平升高，大鼠学习记忆能力下降，提示出现脑老化迹象。因此可以认为，愤怒情绪长期积累引起血浆儿茶酚胺含量升高，从而进一步激活HPA轴，亢进的HPA轴分泌大量CORT，损伤海马组织而加速脑老化进程。
参考文献
[1] 詹向红，刘胜利，江虹等. 愤怒情志表达方式及特质对自主神经的影响[J].中华中医药杂志.2011，26（7）：1475-1478.
[2] Williams JE， Johnson AM， Heiss G， et al. Association between exposure to combat-related stress and psychological health in aging men： the Atherosclerosis Risk in Communities （ARIC） Study[J]. J Trauma Stress. 2010，23（3）：358-366.
[3] 李文彬，韦丰，范明等.D-半乳糖在小鼠上诱导的拟脑老化效应[J].中国药理学与毒理学杂志. 1995，9（2）：93-95.
[4] 陈伟强，程义勇，李树田等.心理应激对大鼠旷场行为的影响及酪氨酸干预作用研究[J].中国应用生理学杂志.2009，25（1）：125-128.
[5] Mc Ewen BS， Magarinos AM. Stress effects on morphology and function of the hippocampus[J].Ann N Y Acad Sci，1997，821：271-284.[6] De Kloet ER， Vreugdenhil E， Oitzl MS， et al. Brain corticosteroid receptor， balance in health and disease [J]. Endocr Rev，1998，19（3）：269-301.