【摘 要】
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目的:构建包装趋化因子CX3C的配体1(CX3CL1)RNA干扰慢病毒载体.方法:参考目的基因CX3CL1序列,设计PCR引物扩增相应的干扰序列,然后将干扰序列连接至pLVX-shRNA2酶切后的线性
【机 构】
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中国人民解放军总医院第二医学中心神经内科 北京100853
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目的:构建包装趋化因子CX3C的配体1(CX3CL1)RNA干扰慢病毒载体.方法:参考目的基因CX3CL1序列,设计PCR引物扩增相应的干扰序列,然后将干扰序列连接至pLVX-shRNA2酶切后的线性化载体上,通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆,即为构建成功的pLVX-shRNA2-CX3CL1慢病毒干扰载体.将构建好的慢病毒干扰载体同慢病毒包装载体共同转染293T细胞,收集上清,纯化浓缩后即为pLVX-shRNA2-CX3CL1慢病毒.最后将慢病毒感染BMSCs细胞,QPCR检测慢病毒的干扰效率.结果:经过酶切能切出大小约为6500bp和1350bp的两条带,获得与预期结果相一致的DNA片段,并通过测序验证了序列的准确性,成功构建CX3CL1 RNA慢病毒干扰载体.然后经过包装、纯化浓缩后得到pLVX-shRNA2-CX3CL1慢病毒.QPCR结果表明干扰组明显抑制了CX3CL1mRNA的表达,干扰效率在70％以上.结论:成功构建包装CX3CL1干扰慢病毒载体,并证实其显著沉默了BMSCs细胞CX3CL1的表达,为CX3CL1在BMSCs移植的大鼠缺血性脑卒中炎症反应的机制研究奠定基础.
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