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摘 要：外源性蛋白酶在过去15～20年中已经成为商用混合酶制剂的一部分，但仅在过去5～10年内才作为单一组分的商用酶——蛋白酶——上市。作为混合酶制剂的组成成分（通常还含有各种碳水化合物酶或糖酶和/或植酸酶），很难将各个组分成分的贡献分开，同时每一种成分的功效具有隱性的价值而不是明确的价值。然而，单一组分酶制剂的攻效可以在不同的生产和营养条件下轻松地测定，并且它们与其他酶的互补性也很容易描述清楚。非反刍动物饲料添加外源性蛋白酶的动机是在保持动物生产性能的前提下显著降低饲料成本。这一目标通常是用给最低成本配方中的酶提供的营养基质替换日粮中昂贵的蛋白质/氨基酸源来实现的。最近的重点已经从这种经典的方法转向为蛋白酶应用中的所谓“额外蛋白（extra-proteinaceous）”效应，包括环境效益、垫料管理、肠道恢复力、均匀性和微生物稳定性。虽然这些“次要”效应可能并不是动物生产使用蛋白酶的主要动机，但它们越来越明显，且需要进行解释。此外，如果能够了解这些效应，那么它们可以主动转化成生产优势，如较低的饲料转化率和较高的日增重。
本综述的目的是简要总结当前非反刍动物生产中单一组分外源性蛋白酶应用技术的现状，并提出可以解释“额外蛋白”效应的机制。最后将讨论可提高外源性蛋白酶对动物生产性能产生有益作用的日粮/动物因素。
关键词：蛋白酶；蛋白质；家禽；猪；氨基酸；营养
中图分类号：S816 文献标志码：C 文章编号：1001-0769（2018）01-0065-03
饲用酶是一个激动人心的成功案例。从β-葡聚糖酶在欧洲斯堪的纳维亚的出现，到阿拉伯木聚糖酶在西欧、加拿大和澳大利亚的发展，再到植酸酶、淀粉酶和蛋白酶在全球范围内的出现。现今，全球饲用酶市场接近10亿美元，并且还在迅速增长中。蛋白酶，作为独立的酶，是饲用酶市场的一个后起之秀，仅在过去的5～10年才成为特定市场和研究领域的焦点。然而，近20年来，蛋白酶的活性在一系列混合产物中被公布出来，但其有益的效应是隐式的，而不是明确的。研究饲用酶的“生命周期”在一定程度上是可以预测的，最初的重点是目标营养物质，如碳水化合物酶和能量、植酸酶和磷、脂肪酶和脂质、蛋白酶和蛋白质，但随后快速拓展到其他营养物质。就植酸酶的研究而言，早期的重点是磷，且在一定程度上是针对钙，之后是针对氨基酸和能量。今天，植酸酶和植酸盐在对动物肠道健康、蛋白质沉积、肌醇、离子平衡、植酸源和特征变化等的影响方面已经出现了许多细微差别。鉴于至少需要有20～30年的饲用酶商业化应用的可持续研究（由植酸酶带头）所积累的基础知识，蛋白酶的技术知识小车正以更加快的步伐在移动。最初对外源性蛋白酶在动物生产中作用的研究是针对其对动物（主要是仔猪和肉仔鸡）生产性能的作用，随后是对氮消化率的影响（下文将更详细地描述）。研究人员探索了氨基酸和其他非蛋白质营养物如脂肪的回肠消化率以及蛋白酶与各种日粮成分之间的相互作用。在现代的参考条件下，蛋白酶研究正在积极查找证据，以证明蛋白酶通过改变动物肠道黏膜的完整性、氨基酸转运、环境可持续性和肠道伸张强度使肠道健康出现有益的改变。本文的目的是介绍外源性蛋白酶在非反刍动物生产领域中的应用文献，并提出蛋白酶的作用远超出提高氨基酸和蛋白质消化率的作用机制。最后，提出会影响蛋白酶作用大小和一致性的各种因素，并讨论它们的影响。
1 外源性蛋白酶对动物生产性能的影响
Lewis等（1955）和Baker等（1956）首开将外源性蛋白酶用于动物饲料之大门。Lewis等（1955）公布了一个系列的三项仔猪研究结果（其中一项研究按三个独立部分进行并报道，结果总共进行了六次试验），结果发现添加1%的胃蛋白酶、胰酶和木瓜蛋白酶可显著降低饲料转化率（Feed Conversion Rate，FCR）。此外，胃蛋白酶和胰酶对FCR的有益作用似乎是独立的，但当将这三项研究的结果结合起来时，胃蛋白酶和胰酶的联合作用使日增重增加约27%、FCR降低约43点（由2.49降到2.06）。当各种酶单独添加时，胃蛋白酶（2.88对2.20）和木瓜蛋白酶（2.82对2.36）都能够降低FCR，表明蛋白水解活性是一个重要的贡献因子而不是胰蛋白酶混合物中的其他酶。Lewis等（1955）和Baker等（1956）的研究重点是仔猪的断奶和豆粕代替脱脂奶粉的潜力。
继Lewis、Baker和同事在20世纪50年代利用粗蛋白提取物进行开创性研究之后，现今的研究工作主要是探索从微生物发酵而不是直接从胰腺提取物中获得蛋白酶的酶解作用。Castanon和Marquardt（1989）可能是现代第一个发表有关专门生产的单一组分外源性蛋白酶在动物生产中作用的研究人员，他们评估了各种酶（包括来自地衣芽孢杆菌的蛋白酶）在提高蚕豆在来航鸡日粮中营养价值上的潜力。在含>900 g/kg大豆的饲料中添加0.25%（而不是0.50%）的蛋白酶，可以显著提高来航鸡第14天至第21天的增重（由61.0 g增到67.9 g），并能显著降低其第7天至第21天的FCR（由2.63降到2.49）。但是，当在加入酶之前对蚕豆进行高温高压处理时，没有观察到类似的反应，表明酶的某些有益作用与热不稳定的抗营养因子的降解有关。
继Castanon和Marquardt（1989）的早期研究之后，Huo等（1993）研究指出，真菌性和细菌性蛋白酶在体外可以降低生豆粕中胰蛋白酶抑制剂和凝集素的活性。随后，Guenter等（1995）研究表明，蛋白酶使饲喂以半精制菜籽油为基础日粮的肉鸡日增重提高3%和FCR降低2%。 Guenter等（1995）和Hessing等（1996）提供的数据评估了酸性或碱性蛋白酶在降低豆粕中凝集素、胰蛋白酶抑制剂和抗原蛋白的抗营养作用方面的潜力。得出的结论是，酸性而不是碱性蛋白酶在体外具有降解大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白以及Kunitz型大豆胰蛋白酶抑制剂的能力，但是这两种蛋白酶对凝集素都没有作用。同时，这些作用体现在生产性能的改善上：第7～27天的采食量和增重显著增加，氮的回肠表观消化率系数由0.76提高0.85。该作者据此认为，在介绍这些纯粹是针对大豆中各种蛋白质的抗营养作用的变化时必须极其小心。最近，Rooke等（1998）证明酸性而不是碱性蛋白酶可以提高刚断奶仔猪的日增重，并可在体外降低大豆蛋白的抗原性。为了进一步了解20世纪90年代已发表的有关蛋白酶在降低大豆中抗营养因子作用的论文，Thorpe和Beal（2001）很好地进行了总结。 20世纪90年代后期到21世纪初，研究人员对用蛋白酶特异降解蛋白质抗营养因子的兴趣似乎出现下降，重点转向更经典的对营养和生产指标的影响上。Marsman等（1997）使用肉鸡来探讨商用中性蛋白酶对提高半合成大豆型日糧营养价值的能力，但结果发现中性蛋白酶不会改善雏鸡的日增重或FCR，不过氮的表观回肠消化率系数显著提高（由0.837增至0.852），NSP的消失率增加（由0.145增至0.206）。O’doherty和Forde（1999）观察发现，当日粮添加外源性中性蛋白酶时，生长和肥育猪喂给含有400 g/kg大豆的日粮，它们的日增重由0.862 kg/d增至0.887 kg/d，FCR由2.62降至2.50。Ghazi等（2002）利用幼龄和成年肉鸡评估了各种蛋白酶在提高豆粕营养价值方面的能力。试验采用了两种蛋白酶，一种是来自芽孢杆菌属的碱性蛋白酶，另一种是来自曲霉属的酸性蛋白酶，结果发现虽然这两种蛋白酶在第27天能够减少鸡血清中的抗大豆抗体水平，但仅分离自曲霉属的蛋白酶可提高肉鸡的日增重（由36 g/d增至41 g/d）和氮的回肠表观消化率（由0.78增至0.83）。有趣的是，当使用精确的饲喂法时，来自曲霉的酸性蛋白酶在一个试验中将真代谢能从11.4 MJ/kg提高到13.1 MJ/kg，并且在一秒钟内从11.0 MJ/kg增加到12.6 MJ/kg，而来自芽孢杆菌的蛋白酶没有这种效果。
各种外源性蛋白酶在功效上的差异在多种情况下得到证实，但鉴于所用蛋白酶的详细情况有限而不容易解释。例如，Simbaya等（1996）观察发现，当肉鸡饲喂菜籽粕半合成日粮时，5种不同的蛋白酶在提高动物生产性能方面的效力差异显著。遗憾的是，此研究所用的5种蛋白酶仅用G、D、M、N和O表示，没有关于它们来源的微生物、蛋白质特性等方面进一步的信息。然而，G蛋白酶能将雏鸡的FCR从1.52降低到1.42，而D蛋白酶对FCR没有效果（1.52对1.53）。有趣的是，第2个试验证实了G蛋白酶对含220 g/kg而非170 g/kg粗蛋白的日粮有作用，这表明蛋白酶对雏鸡生产性能有不同作用的部分原因可能与对照日粮中粗蛋白浓度有关。最后，Simbaya等（1996）发现，G蛋白酶（在几个试验中均产生最有应用前景效应的蛋白酶）成功降低了采食小麦/豆粕基础日粮的雏鸡的FCR（由1.41降至1.35），但对采食小麦/油菜籽基础日粮的雏鸡没有效果（1.42对1.43）。
Odetallah等（2003）指出，当玉米/大豆型日粮添加来自地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）的角蛋白酶时，肉鸡开食料的性能有所改善，但是该效应在所报道的三个独立的试验中改善程度不一致。此外，添加角蛋白酶的有益作用似乎偏向于雏鸡，其有益效果并没有持续到出栏，这一观察结果随后得到Odetallah等（2005）的证实。Angel等（2010）评估了分离自Nocardiopsis prasina的单一组分蛋白酶在幼龄肉仔鸡的玉米/大豆日粮中的剂量敏感性变化（正对照为22.5%，负对照为20.5%，氨基酸减少量与这些粗蛋白的变化成正比）。从第7天至第22天，正对照组肉鸡增重711 g，负对照组肉鸡为661 g。按剂量依赖性方法添加单一组分蛋白酶，可以将体重从661 g增加至708 g，增重和FCR应答最佳时的添加剂量约为200 g/t饲料。Freitas等（2011）在一项利用相同外源性蛋白酶的试验中观察到了肉鸡生产性能上的类似改善。这些作者在第1天至第40天给肉鸡饲喂营养含量充足的玉米/大豆型日粮或粗蛋白和氨基酸水平稍微减少的相同日粮。单一组分蛋白酶对肉鸡的增重没有影响，但是可以将采食蛋白质和易消化氨基酸稍微减少的日粮的肉鸡FCR从1.75降低到1.72，具体下降程度取决于蛋白酶的添加剂量（观察到一个二次方程式的应答效应）。
Wang等（2008）探讨了日粮的蛋白质源（豆粕或棉籽粕）与外源性蛋白酶对肉鸡生产性能的相互作用。总体而言，蛋白酶的作用是正向的。不过，就增重的提高幅度而言，开食阶段的提高程度要高于育肥阶段的。Barekatain等（2013）发现，当向以玉米/豆粕为基础日粮并含有不同浓度梯度的高粱干酒糟及其可溶物的饲料中添加外源性蛋白酶后，肉鸡的增重提高。此外，在日粮含有较高浓度的高粱干酒糟及其可溶物时效果更显著，特别是FCR的改善程度更大。O’Shea等（2014）利用生长—育肥猪评估了木聚糖酶和蛋白酶在以菜籽粕为基础日粮并添加了小麦干酒糟粕及其可溶物的饲料中的相互作用，发现蛋白酶对猪的生产性能影响有限，但能够显著提高能量的回肠表观消化率。最近，Zuo等（2015）发现，向断奶仔猪的日粮添加蛋白酶，可使平均日增重从258 g增加到293 g，使FCR从1.21降低到1.17。
（未完，待续见2018年第5期）
原题名：Toward optimal value creation through the application of exogenous mono-component protease in the diets of non-ruminants（英文）
原作者：Aaron J. Cowieson、Franz F. Roos（DSM公司）
本综述的目的是简要总结当前非反刍动物生产中单一组分外源性蛋白酶应用技术的现状，并提出可以解释“额外蛋白”效应的机制。最后将讨论可提高外源性蛋白酶对动物生产性能产生有益作用的日粮/动物因素。
关键词：蛋白酶；蛋白质；家禽；猪；氨基酸；营养
中图分类号：S816 文献标志码：C 文章编号：1001-0769（2018）01-0065-03
饲用酶是一个激动人心的成功案例。从β-葡聚糖酶在欧洲斯堪的纳维亚的出现，到阿拉伯木聚糖酶在西欧、加拿大和澳大利亚的发展，再到植酸酶、淀粉酶和蛋白酶在全球范围内的出现。现今，全球饲用酶市场接近10亿美元，并且还在迅速增长中。蛋白酶，作为独立的酶，是饲用酶市场的一个后起之秀，仅在过去的5～10年才成为特定市场和研究领域的焦点。然而，近20年来，蛋白酶的活性在一系列混合产物中被公布出来，但其有益的效应是隐式的，而不是明确的。研究饲用酶的“生命周期”在一定程度上是可以预测的，最初的重点是目标营养物质，如碳水化合物酶和能量、植酸酶和磷、脂肪酶和脂质、蛋白酶和蛋白质，但随后快速拓展到其他营养物质。就植酸酶的研究而言，早期的重点是磷，且在一定程度上是针对钙，之后是针对氨基酸和能量。今天，植酸酶和植酸盐在对动物肠道健康、蛋白质沉积、肌醇、离子平衡、植酸源和特征变化等的影响方面已经出现了许多细微差别。鉴于至少需要有20～30年的饲用酶商业化应用的可持续研究（由植酸酶带头）所积累的基础知识，蛋白酶的技术知识小车正以更加快的步伐在移动。最初对外源性蛋白酶在动物生产中作用的研究是针对其对动物（主要是仔猪和肉仔鸡）生产性能的作用，随后是对氮消化率的影响（下文将更详细地描述）。研究人员探索了氨基酸和其他非蛋白质营养物如脂肪的回肠消化率以及蛋白酶与各种日粮成分之间的相互作用。在现代的参考条件下，蛋白酶研究正在积极查找证据，以证明蛋白酶通过改变动物肠道黏膜的完整性、氨基酸转运、环境可持续性和肠道伸张强度使肠道健康出现有益的改变。本文的目的是介绍外源性蛋白酶在非反刍动物生产领域中的应用文献，并提出蛋白酶的作用远超出提高氨基酸和蛋白质消化率的作用机制。最后，提出会影响蛋白酶作用大小和一致性的各种因素，并讨论它们的影响。
1 外源性蛋白酶对动物生产性能的影响
Lewis等（1955）和Baker等（1956）首开将外源性蛋白酶用于动物饲料之大门。Lewis等（1955）公布了一个系列的三项仔猪研究结果（其中一项研究按三个独立部分进行并报道，结果总共进行了六次试验），结果发现添加1%的胃蛋白酶、胰酶和木瓜蛋白酶可显著降低饲料转化率（Feed Conversion Rate，FCR）。此外，胃蛋白酶和胰酶对FCR的有益作用似乎是独立的，但当将这三项研究的结果结合起来时，胃蛋白酶和胰酶的联合作用使日增重增加约27%、FCR降低约43点（由2.49降到2.06）。当各种酶单独添加时，胃蛋白酶（2.88对2.20）和木瓜蛋白酶（2.82对2.36）都能够降低FCR，表明蛋白水解活性是一个重要的贡献因子而不是胰蛋白酶混合物中的其他酶。Lewis等（1955）和Baker等（1956）的研究重点是仔猪的断奶和豆粕代替脱脂奶粉的潜力。
继Lewis、Baker和同事在20世纪50年代利用粗蛋白提取物进行开创性研究之后，现今的研究工作主要是探索从微生物发酵而不是直接从胰腺提取物中获得蛋白酶的酶解作用。Castanon和Marquardt（1989）可能是现代第一个发表有关专门生产的单一组分外源性蛋白酶在动物生产中作用的研究人员，他们评估了各种酶（包括来自地衣芽孢杆菌的蛋白酶）在提高蚕豆在来航鸡日粮中营养价值上的潜力。在含>900 g/kg大豆的饲料中添加0.25%（而不是0.50%）的蛋白酶，可以显著提高来航鸡第14天至第21天的增重（由61.0 g增到67.9 g），并能显著降低其第7天至第21天的FCR（由2.63降到2.49）。但是，当在加入酶之前对蚕豆进行高温高压处理时，没有观察到类似的反应，表明酶的某些有益作用与热不稳定的抗营养因子的降解有关。
继Castanon和Marquardt（1989）的早期研究之后，Huo等（1993）研究指出，真菌性和细菌性蛋白酶在体外可以降低生豆粕中胰蛋白酶抑制剂和凝集素的活性。随后，Guenter等（1995）研究表明，蛋白酶使饲喂以半精制菜籽油为基础日粮的肉鸡日增重提高3%和FCR降低2%。 Guenter等（1995）和Hessing等（1996）提供的数据评估了酸性或碱性蛋白酶在降低豆粕中凝集素、胰蛋白酶抑制剂和抗原蛋白的抗营养作用方面的潜力。得出的结论是，酸性而不是碱性蛋白酶在体外具有降解大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白以及Kunitz型大豆胰蛋白酶抑制剂的能力，但是这两种蛋白酶对凝集素都没有作用。同时，这些作用体现在生产性能的改善上：第7～27天的采食量和增重显著增加，氮的回肠表观消化率系数由0.76提高0.85。该作者据此认为，在介绍这些纯粹是针对大豆中各种蛋白质的抗营养作用的变化时必须极其小心。最近，Rooke等（1998）证明酸性而不是碱性蛋白酶可以提高刚断奶仔猪的日增重，并可在体外降低大豆蛋白的抗原性。为了进一步了解20世纪90年代已发表的有关蛋白酶在降低大豆中抗营养因子作用的论文，Thorpe和Beal（2001）很好地进行了总结。 20世纪90年代后期到21世纪初，研究人员对用蛋白酶特异降解蛋白质抗营养因子的兴趣似乎出现下降，重点转向更经典的对营养和生产指标的影响上。Marsman等（1997）使用肉鸡来探讨商用中性蛋白酶对提高半合成大豆型日糧营养价值的能力，但结果发现中性蛋白酶不会改善雏鸡的日增重或FCR，不过氮的表观回肠消化率系数显著提高（由0.837增至0.852），NSP的消失率增加（由0.145增至0.206）。O’doherty和Forde（1999）观察发现，当日粮添加外源性中性蛋白酶时，生长和肥育猪喂给含有400 g/kg大豆的日粮，它们的日增重由0.862 kg/d增至0.887 kg/d，FCR由2.62降至2.50。Ghazi等（2002）利用幼龄和成年肉鸡评估了各种蛋白酶在提高豆粕营养价值方面的能力。试验采用了两种蛋白酶，一种是来自芽孢杆菌属的碱性蛋白酶，另一种是来自曲霉属的酸性蛋白酶，结果发现虽然这两种蛋白酶在第27天能够减少鸡血清中的抗大豆抗体水平，但仅分离自曲霉属的蛋白酶可提高肉鸡的日增重（由36 g/d增至41 g/d）和氮的回肠表观消化率（由0.78增至0.83）。有趣的是，当使用精确的饲喂法时，来自曲霉的酸性蛋白酶在一个试验中将真代谢能从11.4 MJ/kg提高到13.1 MJ/kg，并且在一秒钟内从11.0 MJ/kg增加到12.6 MJ/kg，而来自芽孢杆菌的蛋白酶没有这种效果。
各种外源性蛋白酶在功效上的差异在多种情况下得到证实，但鉴于所用蛋白酶的详细情况有限而不容易解释。例如，Simbaya等（1996）观察发现，当肉鸡饲喂菜籽粕半合成日粮时，5种不同的蛋白酶在提高动物生产性能方面的效力差异显著。遗憾的是，此研究所用的5种蛋白酶仅用G、D、M、N和O表示，没有关于它们来源的微生物、蛋白质特性等方面进一步的信息。然而，G蛋白酶能将雏鸡的FCR从1.52降低到1.42，而D蛋白酶对FCR没有效果（1.52对1.53）。有趣的是，第2个试验证实了G蛋白酶对含220 g/kg而非170 g/kg粗蛋白的日粮有作用，这表明蛋白酶对雏鸡生产性能有不同作用的部分原因可能与对照日粮中粗蛋白浓度有关。最后，Simbaya等（1996）发现，G蛋白酶（在几个试验中均产生最有应用前景效应的蛋白酶）成功降低了采食小麦/豆粕基础日粮的雏鸡的FCR（由1.41降至1.35），但对采食小麦/油菜籽基础日粮的雏鸡没有效果（1.42对1.43）。
Odetallah等（2003）指出，当玉米/大豆型日粮添加来自地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）的角蛋白酶时，肉鸡开食料的性能有所改善，但是该效应在所报道的三个独立的试验中改善程度不一致。此外，添加角蛋白酶的有益作用似乎偏向于雏鸡，其有益效果并没有持续到出栏，这一观察结果随后得到Odetallah等（2005）的证实。Angel等（2010）评估了分离自Nocardiopsis prasina的单一组分蛋白酶在幼龄肉仔鸡的玉米/大豆日粮中的剂量敏感性变化（正对照为22.5%，负对照为20.5%，氨基酸减少量与这些粗蛋白的变化成正比）。从第7天至第22天，正对照组肉鸡增重711 g，负对照组肉鸡为661 g。按剂量依赖性方法添加单一组分蛋白酶，可以将体重从661 g增加至708 g，增重和FCR应答最佳时的添加剂量约为200 g/t饲料。Freitas等（2011）在一项利用相同外源性蛋白酶的试验中观察到了肉鸡生产性能上的类似改善。这些作者在第1天至第40天给肉鸡饲喂营养含量充足的玉米/大豆型日粮或粗蛋白和氨基酸水平稍微减少的相同日粮。单一组分蛋白酶对肉鸡的增重没有影响，但是可以将采食蛋白质和易消化氨基酸稍微减少的日粮的肉鸡FCR从1.75降低到1.72，具体下降程度取决于蛋白酶的添加剂量（观察到一个二次方程式的应答效应）。
Wang等（2008）探讨了日粮的蛋白质源（豆粕或棉籽粕）与外源性蛋白酶对肉鸡生产性能的相互作用。总体而言，蛋白酶的作用是正向的。不过，就增重的提高幅度而言，开食阶段的提高程度要高于育肥阶段的。Barekatain等（2013）发现，当向以玉米/豆粕为基础日粮并含有不同浓度梯度的高粱干酒糟及其可溶物的饲料中添加外源性蛋白酶后，肉鸡的增重提高。此外，在日粮含有较高浓度的高粱干酒糟及其可溶物时效果更显著，特别是FCR的改善程度更大。O’Shea等（2014）利用生长—育肥猪评估了木聚糖酶和蛋白酶在以菜籽粕为基础日粮并添加了小麦干酒糟粕及其可溶物的饲料中的相互作用，发现蛋白酶对猪的生产性能影响有限，但能够显著提高能量的回肠表观消化率。最近，Zuo等（2015）发现，向断奶仔猪的日粮添加蛋白酶，可使平均日增重从258 g增加到293 g，使FCR从1.21降低到1.17。
（未完，待续见2018年第5期）
原题名：Toward optimal value creation through the application of exogenous mono-component protease in the diets of non-ruminants（英文）
原作者：Aaron J. Cowieson、Franz F. Roos（DSM公司）