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摘要 大麦条纹花叶病毒Barley stripe mosaic virus（BSMV）是我国进境植物检疫性有害生物。为提高大麦条纹花叶病毒检测的灵敏度和特异性，缩短检测周期，根据该病毒不同分离株外壳蛋白（coat protein， CP）基因的保守序列设计特异性的引物和探针，建立了BSMV的实时荧光RT-PCR检测方法。结果表明，本检测方法特异性强，对南方菜豆花叶病毒Southern bean mosaic virus（SBMV）、小麦线条花叶病毒Wheat streak mosaic virus（WSMV）、玉米褪绿斑驳病毒Maize chlorotic mottle virus（MCMV）、烟草环斑病毒Tobacco ringspot virus（TRSV）、菜豆荚斑驳病毒Bean pod mottle virus（BPMV）和番茄环斑病毒Tomato ringspot virus（ToRSV）6种病毒均无交叉扩增;且检测方法灵敏度高，对RNA模板的最低检测限达到5×10-4 ng/μL，与双抗体夹心酶联免疫吸附法（DAS-ELISA）和普通RT-PCR相比，本方法的灵敏度分别提高了10倍和100倍。此外，我们利用该方法对12批进口大麦进行检测，发现6批大麦中检出大麦条纹花叶病毒，占比约50%。总之，本研究建立的熒光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性强等优点，适合于BSMV的快速检测。
关键词 大麦条纹花叶病毒; 荧光定量PCR; 大麦; RT-PCR; ELISA
中图分类号： S 435.123
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.
2020388
Establishment and application of fluorescence quantitative PCR detection method for Barley stripe mosaic virus
WANG Lishan1，2， WANG Haiyang2， QIAN Yunkai2， GAO Fei2， WU Xi2， WANG Xiuping1， LIU Jiqin2*
（1. Hebei Normal University of Science and Technology， Qinhuangdao 066004， China;
2. Qinhuangdao Custom Technical Center， Qinhuangdao 066004， China）
Abstract
Barley stripe mosaic virus （BSMV） is a quarantine pest in China. In order to improve the detection sensitivity， specificity and shorten the detection cycle， based on the conserved sequences in coat protein genes of different BSMV isolates， we established a real-time fluorescent RT-PCR detection method with specific primers and TaqMan probe. The results showed that this method could be only used for BSMV， but not Southern bean mosaic virus （SBMV）， Wheat streak mosaic virus （WSMV）， Maize chlorotic mottle virus （MCMV）， Tobacco ring spot virus （TRSV）， Bean pod mottle virus （BPMV） or Tomato ringspot virus （ToRSV）. The minimum detection limit of template RNA was 5×10-4 ng/μL. Compared with double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay （DAS-ELISA） or ordinary RT-PCR， the sensitivity was increased by 10 or 100 times， respectively. In addition， BSMV was detected in six of 12 batches of imported barley with this method. The real-time PCR method is a rapid， sensitive and highly specific method for BSMV.
Key words
Barley stripe mosaic virus; fluorescence quantitative PCR; barley; RT-PCR; ELISA
大麦条纹花叶病毒Barley stripe mosaic virus（BSMV）是大麦病毒属Hordeivirus的代表成员[1]，主要侵染大麦、小麦、玉米和野燕麦等禾本科植物，也可侵染藜科和茄科植物。BSMV为无包膜、长杆状的病毒粒体，由外壳蛋白和3种正单链ssRNA（α，β和γ）组成[2-3]，该病毒因来源地不同而分化出不同的株系，且不同株系间存在着传毒特性和寄主范围的差异[4]。BSMV不同株系侵染寄主后，可引起叶片产生细线条至纵向条纹症状，不同寄主植物上产生淡绿色条纹、褪绿、坏死等，被害植株种子小而皱缩，并且严重矮化[5]。BSMV危害症状也因毒株、寄主品种和环境因素而不同，高温（24～30℃）可使症状加重。1910年美国最先发现大麦条纹花叶病毒，1953年-1970年此病害在Montana地区造成的损失达3千万美元，1955年仅在Montana和North Dakota地区大麦就减产25%～30%[6-7]。目前大麦条纹花叶病毒病已成为一种世界性病害。由于种子能传毒，随着世界性种质资源的流通，BSMV传遍各大洲，加拿大、墨西哥、巴西、以色列、日本、巴基斯坦、罗马尼亚、南斯拉夫、土耳其、英国、法国、丹麦、苏联以及澳大利亚等国都有分布[8]，一度严重影响世界大麦产量。该病毒还可通过亲本传给杂交后代，从而造成潜在威胁。1983年欧洲及地中海组织EPPO将大麦条纹花叶病毒列为A2类检疫性有害生物[9]。据报道大麦条纹花叶病毒曾在我国新疆、山东、上海等地大面积流行[10-11]，并传播到我国大部分地区，给我国农业生产造成了巨大损失。2004年孙现超等在北京郊区麦田中发现了大麦条纹花叶病毒，并证实该毒株与之前报道的新疆毒株在种子带毒率和寄主侵染范围方面存在差异[12]。2006 年- 2007年岳红妮等在陕西韩城等地的小麦上也发现了大麦条纹花叶病毒[13]。鉴于该病毒的传播特点及其对农业经济的潜在高危害性，我国将其列为检疫性有害生物。 目前有关大麦条纹花叶病毒的检测主要有生物学、血清学、电镜观察、RT-PCR和免疫捕捉RT-PCR等方法[12，14-15]，但有些检测方法灵敏度不够高，检测周期长，而且可能会出现假阳性。在我国大麦条纹花叶病毒的截获率一直较低，仅2018年宁波邮路口岸首次报道从疑似谷物粉末中截获该病毒[16]。为了提高大麦条纹花叶病毒的检出率，研究一种较为灵敏、准确和快速的检测方法迫在眉睫。目前实时荧光PCR检测技术已广泛应用到植物病毒的快速检测中。闻伟刚等[17-19]根据病毒外壳蛋白（coat protein， CP）基因序列设计引物探针，开发了玉米褪绿斑驳病毒Maize chlorotic mottle virus（MCMV）、菜豆荚斑驳病毒Bean pod mottle virus（BPMV）和小麦线条花叶病毒Wheat streak mosaic virus（WSMV）的实时荧光PCR检测方法，王佳莹等[16]依据大麦条纹花叶病毒RNA2 beta C蛋白基因序列研发了一种实时荧光RT-PCR检測方法。
GenBank序列比对发现大麦条纹花叶病毒的外壳蛋白基因在不同株系间的同源性较高，据此设计特异性的引物和探针，研发实时荧光RT-PCR技术，并将其应用于秦皇岛口岸进口大麦的检测中，以期为海关行政执法部门提供技术保障，以便加强口岸检疫监管，严格执行相关检疫措施，进一步防止该病毒的传播蔓延。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
大麦条纹花叶病毒、小麦线条花叶病毒、玉米褪绿斑驳病毒、南方菜豆花叶病毒Southern bean mosaic virus （SBMV）、烟草环斑病毒Tobacco ringspot virus （TRSV）、菜豆荚斑驳病毒和番茄环斑病毒Tomato ringspot virus （ToRSV）的阳性标准品购自美国Agdia公司，样品为冻干的叶片粉末。BSMV的双抗体夹心酶联（DAS-ELISA）检测试剂盒购自美国Agdia公司。DL2000 DNA Marker购自TaKaRa公司。One Step RT-PCR Kit（RR055A）、One Step RT-PCR Kit（Perfect Real Time， RR064A）、荧光探针、引物均购自TaKaRa公司。北京擎科新业生物技术公司对PCR产物测序。所用仪器：普通PCR仪（ABI 9700）;实时荧光PCR仪（ABI Steponeplus）;Model 4001P电泳仪（Life Technologies）;RNA提取试剂盒（RN53）购自北京艾德莱生物科技有限公司。Multiskan Ascent酶标仪（Thermo Scientific）;Nu Genius凝胶成像仪（Syngene）。
1.2 DAS-ELISA
BSMV、WSMV、MCMV、BPMV、TRSV、SBMV、ToRSV阳性标准品按要求加入2 mL样品提取液，充分混匀后，取100 μL病毒原液用于RNA提取。
取100 μL BSMV病毒原液加入900 μL样品提取液，充分混匀后，得到10-1倍稀释的样品，以此类推，分别得到10-2、10-3、10-4、10-5倍稀释的病毒样品。取100 μL不同稀释浓度的BSMV病毒样品用于DAS-ELISA灵敏度检测，测试方法参照试剂盒说明书。
1.3 普通RT-PCR扩增
RT-PCR扩增体系参照One Step RT-PCR Kit说明书，反应体系为：2×One Step Buffer 25 μL;上下游引物（20 μmol/L）各0.5 μL;RNase free ddH2O 20 μL;PrimeScript One Step Enzyme Mix 2 μL;RNA模板2 μL，总体积50 μL。反应程序为：50℃ 30 min， 94℃ 2 min;94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 20 s，36个循环;72℃ 5 min;4℃保存。使用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
1.4 病毒RNA提取及实时荧光RT-PCR扩增
取100 mg磨碎的大麦粉，按照RNA提取试剂盒说明书进行。实时荧光RT-PCR扩增体系参照One Step RT-PCR Kit （Perfect Real Time）说明书，反应体系为：RNase free ddH2O 5 μL;2×One Step RT-PCR Buffer III 10 μL;ROX reference dye （50×）0.4 μL;上下游引物（20 μmol/L）各0.6 μL;荧光探针（20 μmol/L）0.6 μL;PrimeScriptTM RT Enzyme Mix II 0.4 μL;TaKaRa EX TaqTM HS（5 U/μL）0.4 μL;RNA模板2 μL，总体积20 μL。每个样品做3个平行，并设置阴性对照、阳性对照和水空白对照。反应程序为：42℃ 15 min，95℃ 10 s;95℃ 5 s，60℃ 20 s，共45个循环。实时荧光RT-PCR利用荧光定量PCR仪自带的软件进行结果分析，根据阴性对照结果设定阈值线，扩增曲线及样品Ct值由软件自动生成。
1.5 引物与探针序列
引物与探针序列见表1。
2 结果与分析
2.1 实时荧光RT-PCR检测方法的特异性分析
提取BSMV、WSMV、MCMV、BPMV、TRSV、ToRSV和SBMV阳性标准品的RNA，利用BSMV引物和探针进行扩增，结果显示仅BSMV出现典型的扩增曲线，Ct值为22.42，PCR产物经测序为BSMV病毒序列，而WSMV、MCMV、BPMV、TRSV、ToRSV和SBMV均无扩增（图1），表明BSMV引物和探针具有较强的特异性。 2.2 实时荧光RT-PCR检测方法的灵敏度分析
取100 μL BSMV病毒原液用于RNA提取，经测定RNA浓度为5 ng/μL。将上述RNA依次进行10-1～10-6梯度稀释，每个稀释度做3次重复，实时荧光RT-PCR检测结果发现，10-1～10-4稀释度的Ct分别为26.53，30.61，33.83和38.91，10-5～10-6稀释度均无扩增（图2）。因此实时荧光RT-PCR方法的最低检测限为5×10-4 ng/μL。将上述RNA稀释液用普通RT-PCR方法进行验证，电泳结果表明仅10-1～10-2稀释度有明显的扩增条带，而10-3～10-5稀释度均无扩增，PCR产物经测序为BSMV病毒序列（图3）。因此与普通RT-PCR方法相比，实时荧光RT-PCR的灵敏度提高了100倍。
取100 μL BSMV病毒原液及10-1～10-5稀释度的病毒样品进行DAS-ELISA检测，每个样品做2个平行，结果发现10-1～10-3稀释度的病毒样品OD405
关键词 大麦条纹花叶病毒; 荧光定量PCR; 大麦; RT-PCR; ELISA
中图分类号： S 435.123
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.
2020388
Establishment and application of fluorescence quantitative PCR detection method for Barley stripe mosaic virus
WANG Lishan1，2， WANG Haiyang2， QIAN Yunkai2， GAO Fei2， WU Xi2， WANG Xiuping1， LIU Jiqin2*
（1. Hebei Normal University of Science and Technology， Qinhuangdao 066004， China;
2. Qinhuangdao Custom Technical Center， Qinhuangdao 066004， China）
Abstract
Barley stripe mosaic virus （BSMV） is a quarantine pest in China. In order to improve the detection sensitivity， specificity and shorten the detection cycle， based on the conserved sequences in coat protein genes of different BSMV isolates， we established a real-time fluorescent RT-PCR detection method with specific primers and TaqMan probe. The results showed that this method could be only used for BSMV， but not Southern bean mosaic virus （SBMV）， Wheat streak mosaic virus （WSMV）， Maize chlorotic mottle virus （MCMV）， Tobacco ring spot virus （TRSV）， Bean pod mottle virus （BPMV） or Tomato ringspot virus （ToRSV）. The minimum detection limit of template RNA was 5×10-4 ng/μL. Compared with double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay （DAS-ELISA） or ordinary RT-PCR， the sensitivity was increased by 10 or 100 times， respectively. In addition， BSMV was detected in six of 12 batches of imported barley with this method. The real-time PCR method is a rapid， sensitive and highly specific method for BSMV.
Key words
Barley stripe mosaic virus; fluorescence quantitative PCR; barley; RT-PCR; ELISA
大麦条纹花叶病毒Barley stripe mosaic virus（BSMV）是大麦病毒属Hordeivirus的代表成员[1]，主要侵染大麦、小麦、玉米和野燕麦等禾本科植物，也可侵染藜科和茄科植物。BSMV为无包膜、长杆状的病毒粒体，由外壳蛋白和3种正单链ssRNA（α，β和γ）组成[2-3]，该病毒因来源地不同而分化出不同的株系，且不同株系间存在着传毒特性和寄主范围的差异[4]。BSMV不同株系侵染寄主后，可引起叶片产生细线条至纵向条纹症状，不同寄主植物上产生淡绿色条纹、褪绿、坏死等，被害植株种子小而皱缩，并且严重矮化[5]。BSMV危害症状也因毒株、寄主品种和环境因素而不同，高温（24～30℃）可使症状加重。1910年美国最先发现大麦条纹花叶病毒，1953年-1970年此病害在Montana地区造成的损失达3千万美元，1955年仅在Montana和North Dakota地区大麦就减产25%～30%[6-7]。目前大麦条纹花叶病毒病已成为一种世界性病害。由于种子能传毒，随着世界性种质资源的流通，BSMV传遍各大洲，加拿大、墨西哥、巴西、以色列、日本、巴基斯坦、罗马尼亚、南斯拉夫、土耳其、英国、法国、丹麦、苏联以及澳大利亚等国都有分布[8]，一度严重影响世界大麦产量。该病毒还可通过亲本传给杂交后代，从而造成潜在威胁。1983年欧洲及地中海组织EPPO将大麦条纹花叶病毒列为A2类检疫性有害生物[9]。据报道大麦条纹花叶病毒曾在我国新疆、山东、上海等地大面积流行[10-11]，并传播到我国大部分地区，给我国农业生产造成了巨大损失。2004年孙现超等在北京郊区麦田中发现了大麦条纹花叶病毒，并证实该毒株与之前报道的新疆毒株在种子带毒率和寄主侵染范围方面存在差异[12]。2006 年- 2007年岳红妮等在陕西韩城等地的小麦上也发现了大麦条纹花叶病毒[13]。鉴于该病毒的传播特点及其对农业经济的潜在高危害性，我国将其列为检疫性有害生物。 目前有关大麦条纹花叶病毒的检测主要有生物学、血清学、电镜观察、RT-PCR和免疫捕捉RT-PCR等方法[12，14-15]，但有些检测方法灵敏度不够高，检测周期长，而且可能会出现假阳性。在我国大麦条纹花叶病毒的截获率一直较低，仅2018年宁波邮路口岸首次报道从疑似谷物粉末中截获该病毒[16]。为了提高大麦条纹花叶病毒的检出率，研究一种较为灵敏、准确和快速的检测方法迫在眉睫。目前实时荧光PCR检测技术已广泛应用到植物病毒的快速检测中。闻伟刚等[17-19]根据病毒外壳蛋白（coat protein， CP）基因序列设计引物探针，开发了玉米褪绿斑驳病毒Maize chlorotic mottle virus（MCMV）、菜豆荚斑驳病毒Bean pod mottle virus（BPMV）和小麦线条花叶病毒Wheat streak mosaic virus（WSMV）的实时荧光PCR检测方法，王佳莹等[16]依据大麦条纹花叶病毒RNA2 beta C蛋白基因序列研发了一种实时荧光RT-PCR检測方法。
GenBank序列比对发现大麦条纹花叶病毒的外壳蛋白基因在不同株系间的同源性较高，据此设计特异性的引物和探针，研发实时荧光RT-PCR技术，并将其应用于秦皇岛口岸进口大麦的检测中，以期为海关行政执法部门提供技术保障，以便加强口岸检疫监管，严格执行相关检疫措施，进一步防止该病毒的传播蔓延。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
大麦条纹花叶病毒、小麦线条花叶病毒、玉米褪绿斑驳病毒、南方菜豆花叶病毒Southern bean mosaic virus （SBMV）、烟草环斑病毒Tobacco ringspot virus （TRSV）、菜豆荚斑驳病毒和番茄环斑病毒Tomato ringspot virus （ToRSV）的阳性标准品购自美国Agdia公司，样品为冻干的叶片粉末。BSMV的双抗体夹心酶联（DAS-ELISA）检测试剂盒购自美国Agdia公司。DL2000 DNA Marker购自TaKaRa公司。One Step RT-PCR Kit（RR055A）、One Step RT-PCR Kit（Perfect Real Time， RR064A）、荧光探针、引物均购自TaKaRa公司。北京擎科新业生物技术公司对PCR产物测序。所用仪器：普通PCR仪（ABI 9700）;实时荧光PCR仪（ABI Steponeplus）;Model 4001P电泳仪（Life Technologies）;RNA提取试剂盒（RN53）购自北京艾德莱生物科技有限公司。Multiskan Ascent酶标仪（Thermo Scientific）;Nu Genius凝胶成像仪（Syngene）。
1.2 DAS-ELISA
BSMV、WSMV、MCMV、BPMV、TRSV、SBMV、ToRSV阳性标准品按要求加入2 mL样品提取液，充分混匀后，取100 μL病毒原液用于RNA提取。
取100 μL BSMV病毒原液加入900 μL样品提取液，充分混匀后，得到10-1倍稀释的样品，以此类推，分别得到10-2、10-3、10-4、10-5倍稀释的病毒样品。取100 μL不同稀释浓度的BSMV病毒样品用于DAS-ELISA灵敏度检测，测试方法参照试剂盒说明书。
1.3 普通RT-PCR扩增
RT-PCR扩增体系参照One Step RT-PCR Kit说明书，反应体系为：2×One Step Buffer 25 μL;上下游引物（20 μmol/L）各0.5 μL;RNase free ddH2O 20 μL;PrimeScript One Step Enzyme Mix 2 μL;RNA模板2 μL，总体积50 μL。反应程序为：50℃ 30 min， 94℃ 2 min;94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 20 s，36个循环;72℃ 5 min;4℃保存。使用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
1.4 病毒RNA提取及实时荧光RT-PCR扩增
取100 mg磨碎的大麦粉，按照RNA提取试剂盒说明书进行。实时荧光RT-PCR扩增体系参照One Step RT-PCR Kit （Perfect Real Time）说明书，反应体系为：RNase free ddH2O 5 μL;2×One Step RT-PCR Buffer III 10 μL;ROX reference dye （50×）0.4 μL;上下游引物（20 μmol/L）各0.6 μL;荧光探针（20 μmol/L）0.6 μL;PrimeScriptTM RT Enzyme Mix II 0.4 μL;TaKaRa EX TaqTM HS（5 U/μL）0.4 μL;RNA模板2 μL，总体积20 μL。每个样品做3个平行，并设置阴性对照、阳性对照和水空白对照。反应程序为：42℃ 15 min，95℃ 10 s;95℃ 5 s，60℃ 20 s，共45个循环。实时荧光RT-PCR利用荧光定量PCR仪自带的软件进行结果分析，根据阴性对照结果设定阈值线，扩增曲线及样品Ct值由软件自动生成。
1.5 引物与探针序列
引物与探针序列见表1。
2 结果与分析
2.1 实时荧光RT-PCR检测方法的特异性分析
提取BSMV、WSMV、MCMV、BPMV、TRSV、ToRSV和SBMV阳性标准品的RNA，利用BSMV引物和探针进行扩增，结果显示仅BSMV出现典型的扩增曲线，Ct值为22.42，PCR产物经测序为BSMV病毒序列，而WSMV、MCMV、BPMV、TRSV、ToRSV和SBMV均无扩增（图1），表明BSMV引物和探针具有较强的特异性。 2.2 实时荧光RT-PCR检测方法的灵敏度分析
取100 μL BSMV病毒原液用于RNA提取，经测定RNA浓度为5 ng/μL。将上述RNA依次进行10-1～10-6梯度稀释，每个稀释度做3次重复，实时荧光RT-PCR检测结果发现，10-1～10-4稀释度的Ct分别为26.53，30.61，33.83和38.91，10-5～10-6稀释度均无扩增（图2）。因此实时荧光RT-PCR方法的最低检测限为5×10-4 ng/μL。将上述RNA稀释液用普通RT-PCR方法进行验证，电泳结果表明仅10-1～10-2稀释度有明显的扩增条带，而10-3～10-5稀释度均无扩增，PCR产物经测序为BSMV病毒序列（图3）。因此与普通RT-PCR方法相比，实时荧光RT-PCR的灵敏度提高了100倍。
取100 μL BSMV病毒原液及10-1～10-5稀释度的病毒样品进行DAS-ELISA检测，每个样品做2个平行，结果发现10-1～10-3稀释度的病毒样品OD405