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[摘要]目的探讨白细胞介素6（IL-6）和细胞因子信号转导抑制因子1（SOCS1）在卵巢癌组织中的阳性表达及临床意义。方法采用免疫组化二步法检测不同卵巢组织中IL-6和SOCS1的阳性表达，分析两者的表达及其与卵巢癌临床病理参数间的关系。结果卵巢癌组织中IL-6和SOCS1的阳性表达率高于正常卵巢和良性卵巢肿瘤组织（X2=6.094～28.983，P<0.05）。卵巢癌组织中IL-6的阳性表达与肿瘤的组织学分级、FIGO分期、腹水有关（X2=8.451～14.872，P<0.05），与病理类型、年龄、淋巴结转移无关（P>0.05）。SOCS1阳性表达与肿瘤的组织学分级有关（X2=6.137，P<0.05），与病理类型、FIGO分期、腹水、年龄、淋巴结转移无关（P>0.05）。卵巢癌组织中IL-6与SOCSl的表达呈正相关（r=0.297，P<0.05）。结论IL-6和SOCS1在卵巢癌中高表达，与卵巢癌的发生发展相关。
[关键词]卵巢肿瘤；白细胞介素6；细胞因子信号转导蛋白抑制因子；免疫组织化学
卵巢癌是妇科最致命的恶性肿瘤，全球每年大约有20万人被诊断为卵巢癌，其5年病死率大于60%，严重威胁女性的生命健康。炎性细胞因子在肿瘤的发生及发展过程中起着重要作用，已经明确肿瘤细胞以及炎症细胞产生的细胞因子如白细胞介素-1（IL-1）、IL-6、肿瘤坏死因子-a（TNF-a）和趋化因子等可直接促进恶性肿瘤的进展。卵巢癌组织中过表达的IL-6作用于其受体后，可激活相关传导通路如JAK/STAT、Ras/ERK/MAPK和P13K/AKT等，从而产生促进细胞增殖、抗凋亡、诱导血管增生、细胞浸润和耐药等作用。已有研究表明，IL-6可作为卵巢癌预后的独立预测因子。细胞因子信号转导抑制因子1（SOCS1）是阻断多种细胞因子信号转导过程的负性调控因子，其可直接抑制或通过抑制JAK/STAT、酪氨酸激酶受体（RTK）信号转导通路来阻断相关因子所介导的信号转导，SOCS1的异常表达与卵巢癌的发生发展密切相关。本研究应用免疫组化二步法检测IL-6和SOCSl在不同卵巢组织中的表达，探讨两者在卵巢癌发生发展中的作用。
1材料和方法
1.1材料来源
收集2011年12月-2015年12月在我院初次就诊的105例卵巢癌和40例良性卵巢肿瘤病人的石蜡包埋组织标本，所有标本均经病理检查证实。105例卵巢癌标本按病理类型分为浆液性78例、黏液性20例、子宫内膜样腺癌5例和透明细胞癌2例。卵巢良性肿瘤标本按病理类型分为浆液性28例和黏液性12例。并以30例同期因子宫肌瘤行附件切除的正常卵巢组织标本作为对照组。所有卵巢癌病人均行肿瘤细胞减灭术或分期手术，术前均未接受化疗、放疗及免疫治疗。
1.2主要试剂
兔抗人IL-6多克隆抗体（ab6672，稀释度1：200）及兔抗人SOCSl多克隆抗体（ab83493，稀释度1：200）购自美国Abcam公司，免疫组化PV-6001试剂盒、DAB显色剂购自北京中山金桥生物技术有限公司。
1.3实验方法及结果判定
1.3.1实验方法石蜡包埋组织切片，烤片，并逐级脱蜡、水化。将切片依次放人二甲苯溶液3次，各5min；无水乙醇2次，各5 min，体积分数为0.95的乙醇5min，体积分数为0.70的乙醇5 min，体积分数为0.50的乙醇5 min；自来水冲洗3 min，PBS浸泡3次，各2 min；置于煮沸的含有抗原修复液的高压锅中修复2 min，自然冷却后放入PBS浸泡3次，各5 min，以体积分数为0.03的过氧化氢溶液作用10min，阻断内源性过氧化物酶活性；放人PBS浸泡3次，各5min后，加人一抗37℃温箱孵育1 h；取出后置于PBS浸泡3次，各3 rain，加入IgG生物素連接的二抗37℃温箱孵育30 min；置于PBS浸泡3次，每次5 min，DAB染色1 min，自来水冲洗2 min，苏木精染色5 min，自来水冲洗5 min；随后按浓度梯度依次放于乙醇溶液脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，观察。以PBS代替一抗作为阴性对照，用已知的人乳癌IL-6和SOCS1阳性表达组织作为阳性对照。
1.3.2结果判定采用二级计分法，每张切片随机选取5个高倍视野（400倍），细胞浆、细胞核或间质中有明显棕黄色颗粒为阳性表达，以阳性细胞所占百分比和细胞着色程度分别评估。阳性细胞所占百分比的评分标准为：<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。细胞着色程度评分标准为：无着色或者整个背景淡棕色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。以阳性细胞百分比评分+细胞着色程度评分进行综合评定：结果≥3分为阳性，<3分为阴性。
1.4统计学处理
采用SPSS 19.0软件包进行统计学分析，两组或多组计数资料间的比较采用X2检验；IL-6和SOCS1表达相关性采用Spearman相关分析。
2结果
2.1 IL-6和SOCS1表达
IL-6在卵巢癌组织中表达显著升高，主要表现为卵巢癌细胞浆及间质中出现棕黄或棕褐色颗粒；SOCS1在卵巢癌组织中表达升高，主要表现为卵巢癌细胞浆及胞核中出现棕黄或棕褐色颗粒。在卵巢癌、良性卵巢肿瘤及正常卵巢组织中IL-6的阳性表达率分别为71.43%（75/105）、22.50%（9/40）与16.70%（5/30），其中卵巢癌组织中IL-6的阳性表达率明显高于正常卵巢和良性卵巢肿瘤组织（X2=28.983、28.453，P<0.01），而良性卵巢肿瘤组织和正常卵巢组织中IL-6的阳性表达率差异无显著性（X2=0.365，P>0.05）。卵巢癌、良性卵巢肿瘤及正常卵巢组织中SOCSl的阳性率分别为37.14%（39/105）、15.00%（6/40）与13.30%（4/30），卵巢癌组织中SOCSl的阳性表达率高于良性卵巢肿瘤和正常卵巢组织（X2=6.635、6.094，P>0.05），良性卵巢肿瘤组织和正常卵巢组织中SOCS1的阳性率差异无显著性（P>0.05）。 2.2卵巢癌中IL-6和SOCS1表达与临床病理参数的关系
卵巢癌组织中IL-6阳性表达与组织学分级、FIGO分期、腹水有关（X2=8.451～14.872，P<0.05）；而与肿瘤病理类型、年龄、淋巴结转移无关（P>0.05）。卵巢癌组织中SOCSl阳性表达与组织学分级有关（X2=6.137，P<0.05）；而与病理类型、FIGO分期、腹水、年龄、淋巴结转移无关（P>0.05）。见表1。
2.3卵巢癌组织中IL-6和SOCS1表达率相关性
本文105例卵巢癌组织中，IL-6与SOCS1共阳性35例，共阴性26例。Spearman相关分析表明，IL-6与SOCSl阳性表达呈正相关，差异具有显著性（r=0.297，P<0.05）。
3讨论
3.1不同卵巢组织中IL-6和SOCS1表达的意义
IL-6是迄今为止发现的功能最为广泛的细胞因子之一。近年来研究显示，IL-6在多种恶性肿瘤如多发性骨髓瘤、消化道恶性肿瘤、乳癌、卵巢癌等病人的血清中均有不同程度升高，并已证实IL-6与多种肿瘤的发生、发展及预后存在密切关系。SCAMBIA等早期便发现卵巢癌组织中高水平的IL-6与肿瘤进程及其体积变化有关，同时还降低了卵巢癌细胞对化疗药物的敏感性，缩短了病人的生存时间。已有研究证明，卵巢癌病人血清中IL-6的水平与疾病分期和预后呈正相关，是卵巢癌的独立预后因素。本研究结果与上述报道相符。本文结果表明，卵巢良性肿瘤及正常卵巢组织中IL-6的阳性表达率明显低于卵巢癌组织，且卵巢癌组织中IL-6阳性表达与组织学分级、FIGO分期、腹水呈正相关，说明卵巢癌恶性程度愈高、分期愈晚、腹水越多，IL-6阳性表达愈强，提示IL-6在卵巢癌发生发展过程中发挥重要作用。
SOCS家族是体内重要的抑制因子家族，它们具有相似的结构特点：中间的SH2结构域，C末端的"SOCS盒”，N末端为一段可变序列。SOCS蛋白可被IL-6、IL-10、白血病抑制因子、粒细胞集落刺激因子、Y-干扰素、生长激素等多种细胞因子快速诱导表达。SOCS1是家族中最早被发现的因子，研究发现，SOCS1基因的启动子含有STAT1、STAT3和STAT6的结合位点，将STAT3基因表达封闭后，IL-6无法诱导SOCS1阳性表达。本实验结果显示，卵巢癌组织中SOCS1的表达高于良性卵巢肿瘤和正常卵巢组织，且与组织学分级有关，说明SOCS1也是卵巢癌发生发展过程中的重要因子，卵巢癌分化越低，SOCS1的表达越高，发挥的抑制作用越强。
3.2卵巢癌中IL-6和SOCS1表达的相关性
JAK/STAT信号通路是IL-6下游的重要通路，现已经明确，JAK/STAT信号通路的持续激活与多种恶性肿瘤的发生发展存在密切相关性。因此，SOCS1的激活和表达具有潜在的抑瘤作用。YANG等通过对51例肝细胞癌病人的研究发现，SOCS1基因的启动子处于甲基化状态。也有研究显示，多种恶性肿瘤尤其是血液系统疾病存在SOCS1的启动子甲基化和表达降低，而SOCS1的过表达则可以抑制肿瘤细胞的增殖。SUTHER-LAND等报道，原发性卵巢癌病人SOCS1和SOCS2启动子CpG岛的甲基化率分别为23%和14%，SOCS3的启动子未发现被甲基化，实时PCR也证实SOCS1和SOCS2的表达均低于SOCS3。本文结果表明，卵巢癌组织中SOCS1与IL-6阳性表达呈正相关。然而，SOCS1的阳性表达率低于IL-6，这可能与SOCS1启动子的甲基化有关，使其表达降低，而不足以抑制卵巢癌组织中显著增高的IL-6的作用，从而导致卵巢癌的进展、惡化。但此机制尚待进一步验证，这可能为寻找卵巢癌的治疗方法提供了新靶点、开辟了新思路。
[关键词]卵巢肿瘤；白细胞介素6；细胞因子信号转导蛋白抑制因子；免疫组织化学
卵巢癌是妇科最致命的恶性肿瘤，全球每年大约有20万人被诊断为卵巢癌，其5年病死率大于60%，严重威胁女性的生命健康。炎性细胞因子在肿瘤的发生及发展过程中起着重要作用，已经明确肿瘤细胞以及炎症细胞产生的细胞因子如白细胞介素-1（IL-1）、IL-6、肿瘤坏死因子-a（TNF-a）和趋化因子等可直接促进恶性肿瘤的进展。卵巢癌组织中过表达的IL-6作用于其受体后，可激活相关传导通路如JAK/STAT、Ras/ERK/MAPK和P13K/AKT等，从而产生促进细胞增殖、抗凋亡、诱导血管增生、细胞浸润和耐药等作用。已有研究表明，IL-6可作为卵巢癌预后的独立预测因子。细胞因子信号转导抑制因子1（SOCS1）是阻断多种细胞因子信号转导过程的负性调控因子，其可直接抑制或通过抑制JAK/STAT、酪氨酸激酶受体（RTK）信号转导通路来阻断相关因子所介导的信号转导，SOCS1的异常表达与卵巢癌的发生发展密切相关。本研究应用免疫组化二步法检测IL-6和SOCSl在不同卵巢组织中的表达，探讨两者在卵巢癌发生发展中的作用。
1材料和方法
1.1材料来源
收集2011年12月-2015年12月在我院初次就诊的105例卵巢癌和40例良性卵巢肿瘤病人的石蜡包埋组织标本，所有标本均经病理检查证实。105例卵巢癌标本按病理类型分为浆液性78例、黏液性20例、子宫内膜样腺癌5例和透明细胞癌2例。卵巢良性肿瘤标本按病理类型分为浆液性28例和黏液性12例。并以30例同期因子宫肌瘤行附件切除的正常卵巢组织标本作为对照组。所有卵巢癌病人均行肿瘤细胞减灭术或分期手术，术前均未接受化疗、放疗及免疫治疗。
1.2主要试剂
兔抗人IL-6多克隆抗体（ab6672，稀释度1：200）及兔抗人SOCSl多克隆抗体（ab83493，稀释度1：200）购自美国Abcam公司，免疫组化PV-6001试剂盒、DAB显色剂购自北京中山金桥生物技术有限公司。
1.3实验方法及结果判定
1.3.1实验方法石蜡包埋组织切片，烤片，并逐级脱蜡、水化。将切片依次放人二甲苯溶液3次，各5min；无水乙醇2次，各5 min，体积分数为0.95的乙醇5min，体积分数为0.70的乙醇5 min，体积分数为0.50的乙醇5 min；自来水冲洗3 min，PBS浸泡3次，各2 min；置于煮沸的含有抗原修复液的高压锅中修复2 min，自然冷却后放入PBS浸泡3次，各5 min，以体积分数为0.03的过氧化氢溶液作用10min，阻断内源性过氧化物酶活性；放人PBS浸泡3次，各5min后，加人一抗37℃温箱孵育1 h；取出后置于PBS浸泡3次，各3 rain，加入IgG生物素連接的二抗37℃温箱孵育30 min；置于PBS浸泡3次，每次5 min，DAB染色1 min，自来水冲洗2 min，苏木精染色5 min，自来水冲洗5 min；随后按浓度梯度依次放于乙醇溶液脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，观察。以PBS代替一抗作为阴性对照，用已知的人乳癌IL-6和SOCS1阳性表达组织作为阳性对照。
1.3.2结果判定采用二级计分法，每张切片随机选取5个高倍视野（400倍），细胞浆、细胞核或间质中有明显棕黄色颗粒为阳性表达，以阳性细胞所占百分比和细胞着色程度分别评估。阳性细胞所占百分比的评分标准为：<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。细胞着色程度评分标准为：无着色或者整个背景淡棕色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。以阳性细胞百分比评分+细胞着色程度评分进行综合评定：结果≥3分为阳性，<3分为阴性。
1.4统计学处理
采用SPSS 19.0软件包进行统计学分析，两组或多组计数资料间的比较采用X2检验；IL-6和SOCS1表达相关性采用Spearman相关分析。
2结果
2.1 IL-6和SOCS1表达
IL-6在卵巢癌组织中表达显著升高，主要表现为卵巢癌细胞浆及间质中出现棕黄或棕褐色颗粒；SOCS1在卵巢癌组织中表达升高，主要表现为卵巢癌细胞浆及胞核中出现棕黄或棕褐色颗粒。在卵巢癌、良性卵巢肿瘤及正常卵巢组织中IL-6的阳性表达率分别为71.43%（75/105）、22.50%（9/40）与16.70%（5/30），其中卵巢癌组织中IL-6的阳性表达率明显高于正常卵巢和良性卵巢肿瘤组织（X2=28.983、28.453，P<0.01），而良性卵巢肿瘤组织和正常卵巢组织中IL-6的阳性表达率差异无显著性（X2=0.365，P>0.05）。卵巢癌、良性卵巢肿瘤及正常卵巢组织中SOCSl的阳性率分别为37.14%（39/105）、15.00%（6/40）与13.30%（4/30），卵巢癌组织中SOCSl的阳性表达率高于良性卵巢肿瘤和正常卵巢组织（X2=6.635、6.094，P>0.05），良性卵巢肿瘤组织和正常卵巢组织中SOCS1的阳性率差异无显著性（P>0.05）。 2.2卵巢癌中IL-6和SOCS1表达与临床病理参数的关系
卵巢癌组织中IL-6阳性表达与组织学分级、FIGO分期、腹水有关（X2=8.451～14.872，P<0.05）；而与肿瘤病理类型、年龄、淋巴结转移无关（P>0.05）。卵巢癌组织中SOCSl阳性表达与组织学分级有关（X2=6.137，P<0.05）；而与病理类型、FIGO分期、腹水、年龄、淋巴结转移无关（P>0.05）。见表1。
2.3卵巢癌组织中IL-6和SOCS1表达率相关性
本文105例卵巢癌组织中，IL-6与SOCS1共阳性35例，共阴性26例。Spearman相关分析表明，IL-6与SOCSl阳性表达呈正相关，差异具有显著性（r=0.297，P<0.05）。
3讨论
3.1不同卵巢组织中IL-6和SOCS1表达的意义
IL-6是迄今为止发现的功能最为广泛的细胞因子之一。近年来研究显示，IL-6在多种恶性肿瘤如多发性骨髓瘤、消化道恶性肿瘤、乳癌、卵巢癌等病人的血清中均有不同程度升高，并已证实IL-6与多种肿瘤的发生、发展及预后存在密切关系。SCAMBIA等早期便发现卵巢癌组织中高水平的IL-6与肿瘤进程及其体积变化有关，同时还降低了卵巢癌细胞对化疗药物的敏感性，缩短了病人的生存时间。已有研究证明，卵巢癌病人血清中IL-6的水平与疾病分期和预后呈正相关，是卵巢癌的独立预后因素。本研究结果与上述报道相符。本文结果表明，卵巢良性肿瘤及正常卵巢组织中IL-6的阳性表达率明显低于卵巢癌组织，且卵巢癌组织中IL-6阳性表达与组织学分级、FIGO分期、腹水呈正相关，说明卵巢癌恶性程度愈高、分期愈晚、腹水越多，IL-6阳性表达愈强，提示IL-6在卵巢癌发生发展过程中发挥重要作用。
SOCS家族是体内重要的抑制因子家族，它们具有相似的结构特点：中间的SH2结构域，C末端的"SOCS盒”，N末端为一段可变序列。SOCS蛋白可被IL-6、IL-10、白血病抑制因子、粒细胞集落刺激因子、Y-干扰素、生长激素等多种细胞因子快速诱导表达。SOCS1是家族中最早被发现的因子，研究发现，SOCS1基因的启动子含有STAT1、STAT3和STAT6的结合位点，将STAT3基因表达封闭后，IL-6无法诱导SOCS1阳性表达。本实验结果显示，卵巢癌组织中SOCS1的表达高于良性卵巢肿瘤和正常卵巢组织，且与组织学分级有关，说明SOCS1也是卵巢癌发生发展过程中的重要因子，卵巢癌分化越低，SOCS1的表达越高，发挥的抑制作用越强。
3.2卵巢癌中IL-6和SOCS1表达的相关性
JAK/STAT信号通路是IL-6下游的重要通路，现已经明确，JAK/STAT信号通路的持续激活与多种恶性肿瘤的发生发展存在密切相关性。因此，SOCS1的激活和表达具有潜在的抑瘤作用。YANG等通过对51例肝细胞癌病人的研究发现，SOCS1基因的启动子处于甲基化状态。也有研究显示，多种恶性肿瘤尤其是血液系统疾病存在SOCS1的启动子甲基化和表达降低，而SOCS1的过表达则可以抑制肿瘤细胞的增殖。SUTHER-LAND等报道，原发性卵巢癌病人SOCS1和SOCS2启动子CpG岛的甲基化率分别为23%和14%，SOCS3的启动子未发现被甲基化，实时PCR也证实SOCS1和SOCS2的表达均低于SOCS3。本文结果表明，卵巢癌组织中SOCS1与IL-6阳性表达呈正相关。然而，SOCS1的阳性表达率低于IL-6，这可能与SOCS1启动子的甲基化有关，使其表达降低，而不足以抑制卵巢癌组织中显著增高的IL-6的作用，从而导致卵巢癌的进展、惡化。但此机制尚待进一步验证，这可能为寻找卵巢癌的治疗方法提供了新靶点、开辟了新思路。