探讨mmu-miR-30b与鼠FoxO3 (mFoxO3) mRNA的直接相互作用。
方法经生物信息学分析，利用特异性引物以及定点突变引物从鼠cDNA中分别扩增大小为402 bp、123 bp和299 bp的目的片段，并对123 bp和299 bp片段进行拼接，获得野生型、突变型mFoxO3 mRNA特异性片段，再分别与pmirGLO载体连接，构建野生型、突变型重组双荧光素酶报告基因质粒(pmirGLO-mFoxO3、pmirGLO-mFoxO3 mt)；重组质粒与mmu-miR-30b/mmu-miR-30b inhibitor共转染至HEK293 T细胞，分析其荧光素酶活性；Western blot分析mmu-miR-30b对mFoxO3翻译水平的调控作用。
结果双酶切、琼脂糖凝胶电泳及测序技术结果显示pmirGLO-mFoxO3、pmirGLO-mFoxO3 mt被成功构建；共转染后，pmirGLO组、pmirGLO＋mmu-miR-30b组、pmirGLO＋mmu-miR-30b inhibitor组、pmirGLO-mFoxO3＋mmu-miR-30b组、pmirGLO-mFoxO3＋mmu-miR-30b＋mmu-miR-30b inhibitor组和pmirGLO-mFoxO3 mt＋mmu-miR-30b组的荧光素酶活性水平分别为13.18±0.97、14.35±0.99、12.46±1.20、9.55±1.11、13.71±0.89和10.99±0.92；与pmirGLO＋mmu-miR-30b组相比，pmirGLO-mFoxO3＋mmu-miR-30b组的荧光素酶活性被明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，而pmirGLO-mFoxO3 mt＋mmu-miR-30b组的荧光素酶活性无明显改变，差异无统计学意义(P>0.05)；与pmirGLO-mFoxO3＋mmu-miR-30b组相比，pmirGLO-mFoxO3＋mmu-miR-30b＋mmu-miR-30b inhibitor组的荧光素酶活性有显著性增高，差异有统计学意义(P<0.05)。加强mmu-miR-30b的表达能够显著抑制mFoxO3蛋白的表达(P<0.05)，而削弱mmu-miR-30b的表达则显著增加mFoxO3蛋白的表达(P<0.05)。
结论mFoxO3 mRNA是mmu-miR-30b的靶基因，两者之间存在着直接相互作用。