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摘要：研究蓝莓酒渣中花色苷的超声波辅助提取工艺及花色苷的抗氧化活性，在单因素试验基础上，通过响应面分析法优化超声波辅助提取工艺，建立了花色苷提取的二次项数学模型，测定了其抗DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟自由基的能力。结果表明：蓝莓酒渣花色苷的最佳提取条件为超声时间50 min、液料比33 mL ∶1 g、提取温度 65 ℃，在此条件下，蓝莓酒渣花色苷的提取率为6.092 mg/g，所提酒渣花色苷具有较好的抗氧化活性，0.16 mg/mL花色苷提取液对DPPH自由基的清除率达81.7%，抗超氧阴离子自由基能力达220.89 U/L，对羟自由基的抑制率为82.40%。
关键词：蓝莓酒渣；花色苷；超声波辅助；提取工艺；抗氧化活性
中图分类号： Q946.91 9；O657.5文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0242-05
收稿日期：2014-08-29
基金项目：江苏省自然科学基金（编号：BK2012786）；南京市生物农业项目。
作者简介：刘晨（1990—），女，山东乐陵人，硕士研究生，研究方向为水产品加工及贮藏工程。E-mail：jgee39@sina.com。
通信作者：马艳弘，博士，副研究员，主要从事发酵食品与副产物综合利用研究。Tel：（025）84391287；E-mail：ma_yhhyy@126.com。蓝莓为杜鹃花科越橘属（Vaccinium spp.）植物，是21世纪的功能性保健浆果，被联合国粮农组织（FAO）列为人类五大健康食品之一，富含花青素、黄烷醇、酚酸等多种活性物质[1-3]，有抗氧化、抗炎、抗癌、护肝、抗衰老、软化血管、保护视力、增强人机体免疫力等多种药理保健功效[4-8]，具有极高的经济价值和开发前景。蓝毒花青素（anthocyanins）是蓝莓药理活性的主要物质基础，属黄酮类化合物，常以半乳糖苷、葡萄糖苷、阿拉伯糖苷、芸香糖苷等花色苷形式存在[9-10]。
随着消费者对蓝莓营养保健功能认识的增强，蓝莓汁、蓝莓酱、蓝莓酒等相关产品风靡世界，其中蓝莓酒由于具有营养丰富、酒体醇厚、色泽艳丽、口味绵长、香气宜人等特点而备受消费者推崇。但是在蓝莓酒酿造过程中产生的大量酒渣却并未得到充分利用，而研究认为，蓝莓酒渣中仍含有大量花色苷，利用合理的方法提取蓝莓酒渣中的花色苷、提高蓝莓酒渣资源的综合利用率是当前加速蓝莓产业发展的重要途径之一。
国内外许多学者对花色苷的提取方法做了大量研究，采用的方法主要有溶剂萃取法、酶法辅助法、微波辅助法等[11-13]。借助超声波进行辅助提取是近年来色素提取研究中发展的新技术，这种方法可有效破碎植物细胞壁，具有色素溶出快、提取时间短、萃取效率高等优点[14-19]。众多的研究主要集中在蓝莓果实中花色苷的分离提取，而对于蓝莓酒渣中花色苷的高效提取技术还鲜见报道，因此本试验利用超声波辅助提取法，通过响应面分析法对提取条件进行优化，并探讨其抗氧化活性，以期为提高蓝莓酒渣综合利用率提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料与试剂
蓝莓酒渣，由江苏省句容市万山红遍生物科技有限公司提供；25%蓝莓花色苷标准品，陕西森弗天然制品有限公司；DPPH，上海源叶生物科技有限公司；羟自由基测定试剂盒、抗超氧阴离子自由基测定试剂盒，南京建成生物工程研究所；无水乙醇、柠檬酸、盐酸、氯化钾、醋酸钠等均为分析纯试剂。
1.2仪器设备
DHG-9070电热鼓风干燥箱，上海齐欣科学仪器有限公司；HJ-6A多头磁力搅拌器，常州国华仪器有限公司；KH-500E超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；D-B分光光度计，上海奥析科学仪器有限公司；pH计，梅特勒-托利多仪器有限公司；RE-5220型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；ZD-F12真空冷冻干燥机，南京载智自动化设备有限公司。
1.3试验方法
1.3.1蓝莓酒渣花色苷超声提取工艺将蓝莓酒渣平铺于鼓风干燥箱内，于45 ℃烘干至恒重，用高速粉碎机粉碎后过80目筛。取干粉按一定比例加入柠檬酸酸化的70%乙醇溶液（体积含量，pH值为3），浸泡10 min后置于超声波清洗器中进行不同时间的超声处理。然后置于不同温度磁力搅拌器中避光提取1 h，抽滤，回收滤渣，加入同体积提取液，在相同温度下再提取1次，合并2次上清液，50 ℃旋转蒸发后，选用AB-8大孔树脂进行纯化[20]，流速2 mL/min，待回收液吸光度值达上样提取液吸光度值10%时停止上样。用蒸馏水洗去树脂未吸附杂质，并采用考马斯法和硫酸苯酚法分别测定回收液中蛋白质含量和还原糖含量，当二者无检出时，用柠檬酸酸化的70%乙醇溶液（体积含量，pH值为3）进行洗脱。收集洗脱液于50 ℃旋转蒸发浓缩，冷冻干燥，真空包装后于4 ℃避光贮藏备用。
1.3.2蓝莓酒渣花色苷提取率的测定采用pH示差法[21]测定花色苷含量。准确吸取1mL待测提取液于具塞试管中，再分别加入4 mL pH值为1.0、4.5的缓冲液，避光条件下放置60 min达平衡，利用分光光度计分别测量520、700 nm处的吸光度值。
提取液花色苷含量计算公式：
C=ΔD×M×n×Vε×1×m×1 000；
ΔD=[（D520 nm，pH值1.0-D700 nm，pH值1.0）-（D520 nm，pH值4.5-D700 nm，pH值4.5）]
式中：C为花色苷含量，mg/g；V为提取液总体积，mL；n为稀释倍数；M为矢车菊色素-3-葡萄糖苷的相对分子质量，449.2；ε为矢车菊色素-3-葡萄糖苷的消光系数，26 900；m为样品质量，g；l为光程，1 cm。
实际测定后，将计算结果换算为1 g蓝莓酒渣中含有花色苷的质量（mg）。 1.3.3单因素试验设计以蓝莓酒渣花色苷提取率为考察目标，以柠檬酸酸化的70%乙醇溶液（体积含量，pH值为3）为提取液，在超声功率500 W的条件下，考察不同超声时间、液料比、提取时间对花色苷提取率的影响，提取条件的单因素设计见表1。 表1蓝莓酒渣花色苷提取单因素试验设计
因素水平其他提取条件超声时间10、20、30、40、50、60 min液料比20 mL ∶1 g，提取温度50 ℃，提取1 h，提取2次液料比
5 mL ∶1 g、10 mL ∶1 g、20 mL ∶1 g、30 mL ∶1 g、40 mL ∶1 g、50 mL ∶1 g超声时间30 min，提取温度50 ℃，提取1 h，提取2次
提取温度30、40、50、60、70、80 ℃超声时间30 min，液料比20 mL ∶1 g，提取1 h，提取2次
以上试验均进行2次平行试验，结果取平均值。
1.3.4Box-Behnken试验设计及响应面分析根据单因素试验结果，采用Box-Behnken设计方案，以超声时间A、液料比B、提取温度C为考察因素，以花色苷提取率为响应值，利用Design-Expert8.0.5b软件优化蓝莓酒渣花色苷提取工艺。试验因素水平编码见表2。
表2Box-Behnken试验因素水平编码
水平因素因素A：超声时间
（min）B：液料比
（mL ∶g）C：提取温度
（℃）-14020 ∶15005030 ∶16016040 ∶170
1.3.5蓝莓酒渣花色苷抗氧化活性检测[22-23]
1.3.5.1DPPH自由基清除能力测定配置0.01、0.02、004、0.08、0.16 mg/mL的蓝莓酒渣花色苷溶液，各取2 mL于具塞试管中，每管加入2 mL 2×10-4 mol/L DPPH溶液，摇匀后避光放置30 min。以同浓度维生素C和25%蓝莓花色苷标准品为阳性对照，分别测定517 nm处的吸光度D517 nm。
DPPH·清除率=[1-（D517 nm（i）-D517 nm（j））/D517 nm（o）]×100%。
式中：D517 nm（i）、D517 nm（j）、D517 nm（o）分别为测定条件为2 mL样品溶液 2 mL DPPH溶液、2 mL样品溶液 2 mL无水乙醇、2 mL DPPH溶液 2 mL无水乙醇的吸光度。
1.3.5.2抗超氧阴离子自由基能力测定配制0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 mg/mL的样品溶液，按试剂盒说明书操作，取同浓度维生素C溶液和25%蓝莓花色苷标准品溶液作对照，无水乙醇作空白对照。超氧阴离子自由基清除能力计算公式如下：
抗超氧阴离子活力单位（U/L）=（D550 nm（对照组）-D550 nm（试验组））/（D550 nm（对照组）-D550 nm（标准组））×标准品浓度（mg/mL）×1 000 mL。
1.3.5.3清除羟自由基能力的测定分别取0.01、0.02、004、0.08、0.16 mg/mL样品溶液，按试剂盒说明书操作，其呈色与OH·的多少成正比关系，即吸光度越小，样品对羟自由基的清除能力越强。取同浓度维生素C溶液和25%蓝莓花青素标品溶液作阳性对照，以无水乙醇作空白对照。羟自由基抑制能力计算公式如下：
抑制率=（D对照组-D试验组）/D对照组×100%。
2结果与分析
2.1单因素试验结果与分析
2.1.1超声时间对蓝莓酒渣花色苷提取率的影响如图1所示，随超声时间的延长，蓝莓酒渣花色苷提取率逐渐增大，当提取时间超过50 min以后，提取率基本趋于稳定。这可能是因为当时间达50 min时，在超声作用下酒渣基本完全破壁，继续延长超声时间反而会使部分花色苷分解，因此，50 min 为适宜的超声时间。
2.1.2液料比对蓝莓酒渣花色苷提取率的影响如图2 所示，在液料比30 mL ∶1 g以内，随液料比逐渐增大，花色苷提取率逐渐增加；当液料比达30 mL ∶1 g后，继续增大提取溶剂量，提取率增加极其缓慢。结果说明，增加溶剂量会增大花色苷扩散速度，使提取速度加快，但过量的提取溶剂会导致物料吸收的超声能减少、花色苷溶出不充分，而且过高溶剂量既增加了成本，又加重了后续浓缩负担，因此综合考虑可以确定 30 mL ∶1 g 为最佳液料比。
2.1.3提取温度对蓝莓酒渣花色苷提取率的影响如图3所示，提取温度低于60 ℃时，随着提取温度的增加，花色苷的提取率逐渐增大；60～70 ℃之间，花色苷提取率相对平稳；超过70 ℃后，花色苷提取率反而下降。这是因为花色苷的溶解度会随温度升高而提高，但温度过高会使少部分花色苷结构发生变化，使得提取率下降，因此综合比较可选60 ℃为蓝莓酒渣花色苷适宜的提取温度。
2.2响应面试验设计与结果
2.2.1回归模型建立及方差分析采用Box-Behnken设计方案，以提取率为响应值，优化蓝莓酒渣花色苷提取工艺。试验设计与结果见表3，其中实测值为3次平行试验结果的平均值。
应用Design Expert8.0.5b软件对试验结果进行多元回归
表3响应面试验设计及结果
序号A：超声时
间（min）B：液料比
（mL ∶g）C：提取温
度（℃）提取率（mg/g）实测值预测值10-115.8355.85201-15.9835.973-10-15.7955.84-1105.9325.9551016.1026.106-1015.9375.947-1-105.6545.6481-105.9235.9190006.0216.01100006.0326.01110005.9846.01120116.0756.061310-16.0186.02141106.0566.07150-1-15.7125.72 分析，得到以蓝莓酒渣花色苷提取率为响应值的回归方程为：
花色苷提取率（mg/g）=2.017 42 0.053 071A 0085 525B 0.037 237C-3.62 500×10-4AC-1.450 00×10-4AC-7.750 00×10-5BC-2.966 67×10-4A2-9.141 67×10-4B2-1.966 67×10-4C2。
式中：A为超声时间，min；B为液料比，mL ∶g；C为提取温度， ℃。
对模型进行显著性分析，由表4可知，回归模型极显著（P=0.000 2<0.01），失拟项（P=0.645 7）不显著，实际试验值与预测值具有高度相关性（R2=0.989 8，R2Adj=0.971 5），表明模型与试验值拟合良好[24]，试验方法可信度高，试验得到的2次回归方程能够很好地对响应值进行预测。由表4还可知，3个自变量对响应值的影响程度大小依次为液料比（B）>超声时间（A）>提取温度（C），其中3个因素以及液料比的 2次项（B2）对花色苷提取量影响极显著（P<0.01），超声时间和料液比的交互作用（AB）对花色苷提取量影响显著（P<0.05）。表4方差分析结果
参数平方和自由度均方F值P值显著性模型0.246 366 01790.027 374 00254.036 522 820.000 2极显著A：超声时间0.076 245 12510.076 245 125150.508 554<0.000 1极显著B：液料比0.106 260 510.106 260 5209.759 170 9<0.000 1极显著C：提取温度0.024 310 12510.024 310 12547.988 402 70.001 0极显著AB0.005 256 2510.005 256 2510.375 8841 90.023 4显著AC0.000 84110.000 8411.660 141 4710.254 0BC0.000 240 2510.000 240 250.474 255 6340.521 7A20.003 249 64110.003 249 6416.414 820 2510.052 4B20.030 856 64110.030 856 64160.911 283 490.000 6极显著C20.001 428 10310.001 428 1032.8190871470.154 0残差0.002 532 91750.000 506 583失拟项0.001 268 2530.000 422 750.668 555 6140.645 7不显著纯误差0.001 264 66720.000 632 333总和0.248 898 93314R20.989 8R2Adj0.971 5
2.2.2响应面图分析与优化图4至图6反映了几个因素间的交互作用对蓝莓酒渣花色苷提取率的影响。响应曲面图中曲面的陡峭程度可以表明变量对提取率的影响程度，曲面较陡表明影响较大，反之则较小；等高线图反映了因素间交互作用的强弱，椭圆形表示交互作用显著，圆形表示交互作用不显著[24]。由图4可见，超声时间与液料比交互作用的响应面坡度陡，等高线密集，说明二者交互作用显著；同一超声时间下，随液料比增加，提取率显著增加；与之相比，在同一液料比水平下，随着超声时间的增加，提取率增加幅度较缓。由图5、图6看出，2个因素间交互作用的响应面坡度缓，等高线稀疏，说明二者交互作用不显著，这一结论与方差分析中3个自变量F值大小排序所反映的趋势一致。
2.2.3最优提取工艺条件及验证试验通过软件分析得到蓝莓酒渣花色苷超声辅助法最佳提取工艺为：超声时间4996 min、液料比33.48 mL ∶1 g、提取温度65.15 ℃，在此条件下，蓝莓酒渣花色苷提取率可达6.110 95 mg/g。为了操作方便，修正最佳提取工艺条件为：超声时间50 min、液料比 33 mL ∶1 g、提取温度65 ℃。在此条件下，进行3次平行试验，所得提取率平均值为6.092 mg/g，实测值与预测值相对误差仅为0.31%，说明该优化设计方案可以较好地预测蓝莓酒渣花色苷提取情况。
2.3蓝莓酒渣花色苷抗氧化活性分析
2.3.1DPPH自由基清除能力如图7所示，随着溶液浓度的增加，3种样品清除DPPH自由基能力不断增强，同浓度条件下，维生素C清除DPPH自由基能力高于25%蓝莓花色苷标准品和蓝莓酒渣花色苷。当蓝莓花色苷标准品溶液和蓝莓酒渣花色苷溶液浓度为0.01～0.02 mg/mL时，前者对DPPH
自由基的清除率高于后者；随浓度逐渐增大并大于 0.04 mg/mL 后，前者的清除率低于后者；当蓝莓酒渣花色苷溶液浓度达0.08mg/mL时，清除率达78.59%；浓度达 0.16 mg/mL 时，清除率达81.70%。
2.3.2抗超氧阴离子自由基能力由图8可见，随着溶液浓度的增加，3种样品抗超氧阴离子自由基能力不断增强；相同浓度条件下，维生素C抗自由基能力高于25%蓝莓花色苷标准品和蓝莓酒渣花色苷。25%蓝莓花色苷标准品抗自由基能力在一定浓度内略高于蓝莓酒渣花色苷，当蓝莓酒渣花色苷溶液浓度达0.16 mg/mL时，抗自由基能力达220.89 U/L。
2.3.3羟自由基抑制能力如图9所示，随着3种样品溶液浓度增加，羟自由基抑制率不断提高。同浓度时抗维生素C对羟自由基的抑制能力大于25%蓝莓花色苷标准品、蓝莓酒渣花色苷。当蓝莓花色苷标准品溶液和蓝莓酒渣花色苷溶液浓度为0.01～0.02 mg/mL时，前者自由基抑制率低于后者；随浓度增大为0.04～0.16 mg/mL时，后者自由基清除率低于前者；当蓝莓酒渣花色苷浓度达0.08 mg/mL时，羟自由基清除率达66.54%；浓度达0.16 mg/mL时，羟自由基清除率达82.40%。 综合分析以上3组试验结果可知，蓝莓酒渣花色苷具有较好抗氧化能力，与25%蓝莓花色素苷标准品抗氧化能力接近。
3结论
在单因素试验基础上，通过响应面分析法优化了蓝莓酒渣花色苷最佳提取工艺，建立了可靠的预测模型，得到蓝莓酒渣花色苷最优提取条件为：柠檬酸酸化70%乙醇（体积含量，pH值=3）为提取液，浸泡10 min，液料比33 mL ∶1 g、超声时间50 min、提取温度65 ℃、连续提取2次。此条件下蓝莓酒渣花色苷提取率为6.092 mg/g，与理论预测值基本一致。通过DPPH自由基清除能力、抗超氧自由基能力、羟自由基抑制能力测试发现，所提酒渣花色苷具有较强的抗氧化活性，0.16 mg/mL 的花色苷提取液对DPPH自由基清除率达8170%，抗超氧阴离子自由基能力达220.89 U/L，羟自由基抑制率为82.40%。由此可见，超声辅助提取的蓝莓酒渣花色苷得率较高、抗氧化能力较强，既为节能环保、提高蓝莓酒渣资源的利用率提供了很好的思路，又为蓝莓酒渣花色苷工业化生产提供了试验依据。
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国内外许多学者对花色苷的提取方法做了大量研究，采用的方法主要有溶剂萃取法、酶法辅助法、微波辅助法等[11-13]。借助超声波进行辅助提取是近年来色素提取研究中发展的新技术，这种方法可有效破碎植物细胞壁，具有色素溶出快、提取时间短、萃取效率高等优点[14-19]。众多的研究主要集中在蓝莓果实中花色苷的分离提取，而对于蓝莓酒渣中花色苷的高效提取技术还鲜见报道，因此本试验利用超声波辅助提取法，通过响应面分析法对提取条件进行优化，并探讨其抗氧化活性，以期为提高蓝莓酒渣综合利用率提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料与试剂
蓝莓酒渣，由江苏省句容市万山红遍生物科技有限公司提供；25%蓝莓花色苷标准品，陕西森弗天然制品有限公司；DPPH，上海源叶生物科技有限公司；羟自由基测定试剂盒、抗超氧阴离子自由基测定试剂盒，南京建成生物工程研究所；无水乙醇、柠檬酸、盐酸、氯化钾、醋酸钠等均为分析纯试剂。
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DHG-9070电热鼓风干燥箱，上海齐欣科学仪器有限公司；HJ-6A多头磁力搅拌器，常州国华仪器有限公司；KH-500E超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；D-B分光光度计，上海奥析科学仪器有限公司；pH计，梅特勒-托利多仪器有限公司；RE-5220型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；ZD-F12真空冷冻干燥机，南京载智自动化设备有限公司。
1.3试验方法
1.3.1蓝莓酒渣花色苷超声提取工艺将蓝莓酒渣平铺于鼓风干燥箱内，于45 ℃烘干至恒重，用高速粉碎机粉碎后过80目筛。取干粉按一定比例加入柠檬酸酸化的70%乙醇溶液（体积含量，pH值为3），浸泡10 min后置于超声波清洗器中进行不同时间的超声处理。然后置于不同温度磁力搅拌器中避光提取1 h，抽滤，回收滤渣，加入同体积提取液，在相同温度下再提取1次，合并2次上清液，50 ℃旋转蒸发后，选用AB-8大孔树脂进行纯化[20]，流速2 mL/min，待回收液吸光度值达上样提取液吸光度值10%时停止上样。用蒸馏水洗去树脂未吸附杂质，并采用考马斯法和硫酸苯酚法分别测定回收液中蛋白质含量和还原糖含量，当二者无检出时，用柠檬酸酸化的70%乙醇溶液（体积含量，pH值为3）进行洗脱。收集洗脱液于50 ℃旋转蒸发浓缩，冷冻干燥，真空包装后于4 ℃避光贮藏备用。
1.3.2蓝莓酒渣花色苷提取率的测定采用pH示差法[21]测定花色苷含量。准确吸取1mL待测提取液于具塞试管中，再分别加入4 mL pH值为1.0、4.5的缓冲液，避光条件下放置60 min达平衡，利用分光光度计分别测量520、700 nm处的吸光度值。
提取液花色苷含量计算公式：
C=ΔD×M×n×Vε×1×m×1 000；
ΔD=[（D520 nm，pH值1.0-D700 nm，pH值1.0）-（D520 nm，pH值4.5-D700 nm，pH值4.5）]
式中：C为花色苷含量，mg/g；V为提取液总体积，mL；n为稀释倍数；M为矢车菊色素-3-葡萄糖苷的相对分子质量，449.2；ε为矢车菊色素-3-葡萄糖苷的消光系数，26 900；m为样品质量，g；l为光程，1 cm。
实际测定后，将计算结果换算为1 g蓝莓酒渣中含有花色苷的质量（mg）。 1.3.3单因素试验设计以蓝莓酒渣花色苷提取率为考察目标，以柠檬酸酸化的70%乙醇溶液（体积含量，pH值为3）为提取液，在超声功率500 W的条件下，考察不同超声时间、液料比、提取时间对花色苷提取率的影响，提取条件的单因素设计见表1。 表1蓝莓酒渣花色苷提取单因素试验设计
因素水平其他提取条件超声时间10、20、30、40、50、60 min液料比20 mL ∶1 g，提取温度50 ℃，提取1 h，提取2次液料比
5 mL ∶1 g、10 mL ∶1 g、20 mL ∶1 g、30 mL ∶1 g、40 mL ∶1 g、50 mL ∶1 g超声时间30 min，提取温度50 ℃，提取1 h，提取2次
提取温度30、40、50、60、70、80 ℃超声时间30 min，液料比20 mL ∶1 g，提取1 h，提取2次
以上试验均进行2次平行试验，结果取平均值。
1.3.4Box-Behnken试验设计及响应面分析根据单因素试验结果，采用Box-Behnken设计方案，以超声时间A、液料比B、提取温度C为考察因素，以花色苷提取率为响应值，利用Design-Expert8.0.5b软件优化蓝莓酒渣花色苷提取工艺。试验因素水平编码见表2。
表2Box-Behnken试验因素水平编码
水平因素因素A：超声时间
（min）B：液料比
（mL ∶g）C：提取温度
（℃）-14020 ∶15005030 ∶16016040 ∶170
1.3.5蓝莓酒渣花色苷抗氧化活性检测[22-23]
1.3.5.1DPPH自由基清除能力测定配置0.01、0.02、004、0.08、0.16 mg/mL的蓝莓酒渣花色苷溶液，各取2 mL于具塞试管中，每管加入2 mL 2×10-4 mol/L DPPH溶液，摇匀后避光放置30 min。以同浓度维生素C和25%蓝莓花色苷标准品为阳性对照，分别测定517 nm处的吸光度D517 nm。
DPPH·清除率=[1-（D517 nm（i）-D517 nm（j））/D517 nm（o）]×100%。
式中：D517 nm（i）、D517 nm（j）、D517 nm（o）分别为测定条件为2 mL样品溶液 2 mL DPPH溶液、2 mL样品溶液 2 mL无水乙醇、2 mL DPPH溶液 2 mL无水乙醇的吸光度。
1.3.5.2抗超氧阴离子自由基能力测定配制0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 mg/mL的样品溶液，按试剂盒说明书操作，取同浓度维生素C溶液和25%蓝莓花色苷标准品溶液作对照，无水乙醇作空白对照。超氧阴离子自由基清除能力计算公式如下：
抗超氧阴离子活力单位（U/L）=（D550 nm（对照组）-D550 nm（试验组））/（D550 nm（对照组）-D550 nm（标准组））×标准品浓度（mg/mL）×1 000 mL。
1.3.5.3清除羟自由基能力的测定分别取0.01、0.02、004、0.08、0.16 mg/mL样品溶液，按试剂盒说明书操作，其呈色与OH·的多少成正比关系，即吸光度越小，样品对羟自由基的清除能力越强。取同浓度维生素C溶液和25%蓝莓花青素标品溶液作阳性对照，以无水乙醇作空白对照。羟自由基抑制能力计算公式如下：
抑制率=（D对照组-D试验组）/D对照组×100%。
2结果与分析
2.1单因素试验结果与分析
2.1.1超声时间对蓝莓酒渣花色苷提取率的影响如图1所示，随超声时间的延长，蓝莓酒渣花色苷提取率逐渐增大，当提取时间超过50 min以后，提取率基本趋于稳定。这可能是因为当时间达50 min时，在超声作用下酒渣基本完全破壁，继续延长超声时间反而会使部分花色苷分解，因此，50 min 为适宜的超声时间。
2.1.2液料比对蓝莓酒渣花色苷提取率的影响如图2 所示，在液料比30 mL ∶1 g以内，随液料比逐渐增大，花色苷提取率逐渐增加；当液料比达30 mL ∶1 g后，继续增大提取溶剂量，提取率增加极其缓慢。结果说明，增加溶剂量会增大花色苷扩散速度，使提取速度加快，但过量的提取溶剂会导致物料吸收的超声能减少、花色苷溶出不充分，而且过高溶剂量既增加了成本，又加重了后续浓缩负担，因此综合考虑可以确定 30 mL ∶1 g 为最佳液料比。
2.1.3提取温度对蓝莓酒渣花色苷提取率的影响如图3所示，提取温度低于60 ℃时，随着提取温度的增加，花色苷的提取率逐渐增大；60～70 ℃之间，花色苷提取率相对平稳；超过70 ℃后，花色苷提取率反而下降。这是因为花色苷的溶解度会随温度升高而提高，但温度过高会使少部分花色苷结构发生变化，使得提取率下降，因此综合比较可选60 ℃为蓝莓酒渣花色苷适宜的提取温度。
2.2响应面试验设计与结果
2.2.1回归模型建立及方差分析采用Box-Behnken设计方案，以提取率为响应值，优化蓝莓酒渣花色苷提取工艺。试验设计与结果见表3，其中实测值为3次平行试验结果的平均值。
应用Design Expert8.0.5b软件对试验结果进行多元回归
表3响应面试验设计及结果
序号A：超声时
间（min）B：液料比
（mL ∶g）C：提取温
度（℃）提取率（mg/g）实测值预测值10-115.8355.85201-15.9835.973-10-15.7955.84-1105.9325.9551016.1026.106-1015.9375.947-1-105.6545.6481-105.9235.9190006.0216.01100006.0326.01110005.9846.01120116.0756.061310-16.0186.02141106.0566.07150-1-15.7125.72 分析，得到以蓝莓酒渣花色苷提取率为响应值的回归方程为：
花色苷提取率（mg/g）=2.017 42 0.053 071A 0085 525B 0.037 237C-3.62 500×10-4AC-1.450 00×10-4AC-7.750 00×10-5BC-2.966 67×10-4A2-9.141 67×10-4B2-1.966 67×10-4C2。
式中：A为超声时间，min；B为液料比，mL ∶g；C为提取温度， ℃。
对模型进行显著性分析，由表4可知，回归模型极显著（P=0.000 2<0.01），失拟项（P=0.645 7）不显著，实际试验值与预测值具有高度相关性（R2=0.989 8，R2Adj=0.971 5），表明模型与试验值拟合良好[24]，试验方法可信度高，试验得到的2次回归方程能够很好地对响应值进行预测。由表4还可知，3个自变量对响应值的影响程度大小依次为液料比（B）>超声时间（A）>提取温度（C），其中3个因素以及液料比的 2次项（B2）对花色苷提取量影响极显著（P<0.01），超声时间和料液比的交互作用（AB）对花色苷提取量影响显著（P<0.05）。表4方差分析结果
参数平方和自由度均方F值P值显著性模型0.246 366 01790.027 374 00254.036 522 820.000 2极显著A：超声时间0.076 245 12510.076 245 125150.508 554<0.000 1极显著B：液料比0.106 260 510.106 260 5209.759 170 9<0.000 1极显著C：提取温度0.024 310 12510.024 310 12547.988 402 70.001 0极显著AB0.005 256 2510.005 256 2510.375 8841 90.023 4显著AC0.000 84110.000 8411.660 141 4710.254 0BC0.000 240 2510.000 240 250.474 255 6340.521 7A20.003 249 64110.003 249 6416.414 820 2510.052 4B20.030 856 64110.030 856 64160.911 283 490.000 6极显著C20.001 428 10310.001 428 1032.8190871470.154 0残差0.002 532 91750.000 506 583失拟项0.001 268 2530.000 422 750.668 555 6140.645 7不显著纯误差0.001 264 66720.000 632 333总和0.248 898 93314R20.989 8R2Adj0.971 5
2.2.2响应面图分析与优化图4至图6反映了几个因素间的交互作用对蓝莓酒渣花色苷提取率的影响。响应曲面图中曲面的陡峭程度可以表明变量对提取率的影响程度，曲面较陡表明影响较大，反之则较小；等高线图反映了因素间交互作用的强弱，椭圆形表示交互作用显著，圆形表示交互作用不显著[24]。由图4可见，超声时间与液料比交互作用的响应面坡度陡，等高线密集，说明二者交互作用显著；同一超声时间下，随液料比增加，提取率显著增加；与之相比，在同一液料比水平下，随着超声时间的增加，提取率增加幅度较缓。由图5、图6看出，2个因素间交互作用的响应面坡度缓，等高线稀疏，说明二者交互作用不显著，这一结论与方差分析中3个自变量F值大小排序所反映的趋势一致。
2.2.3最优提取工艺条件及验证试验通过软件分析得到蓝莓酒渣花色苷超声辅助法最佳提取工艺为：超声时间4996 min、液料比33.48 mL ∶1 g、提取温度65.15 ℃，在此条件下，蓝莓酒渣花色苷提取率可达6.110 95 mg/g。为了操作方便，修正最佳提取工艺条件为：超声时间50 min、液料比 33 mL ∶1 g、提取温度65 ℃。在此条件下，进行3次平行试验，所得提取率平均值为6.092 mg/g，实测值与预测值相对误差仅为0.31%，说明该优化设计方案可以较好地预测蓝莓酒渣花色苷提取情况。
2.3蓝莓酒渣花色苷抗氧化活性分析
2.3.1DPPH自由基清除能力如图7所示，随着溶液浓度的增加，3种样品清除DPPH自由基能力不断增强，同浓度条件下，维生素C清除DPPH自由基能力高于25%蓝莓花色苷标准品和蓝莓酒渣花色苷。当蓝莓花色苷标准品溶液和蓝莓酒渣花色苷溶液浓度为0.01～0.02 mg/mL时，前者对DPPH
自由基的清除率高于后者；随浓度逐渐增大并大于 0.04 mg/mL 后，前者的清除率低于后者；当蓝莓酒渣花色苷溶液浓度达0.08mg/mL时，清除率达78.59%；浓度达 0.16 mg/mL 时，清除率达81.70%。
2.3.2抗超氧阴离子自由基能力由图8可见，随着溶液浓度的增加，3种样品抗超氧阴离子自由基能力不断增强；相同浓度条件下，维生素C抗自由基能力高于25%蓝莓花色苷标准品和蓝莓酒渣花色苷。25%蓝莓花色苷标准品抗自由基能力在一定浓度内略高于蓝莓酒渣花色苷，当蓝莓酒渣花色苷溶液浓度达0.16 mg/mL时，抗自由基能力达220.89 U/L。
2.3.3羟自由基抑制能力如图9所示，随着3种样品溶液浓度增加，羟自由基抑制率不断提高。同浓度时抗维生素C对羟自由基的抑制能力大于25%蓝莓花色苷标准品、蓝莓酒渣花色苷。当蓝莓花色苷标准品溶液和蓝莓酒渣花色苷溶液浓度为0.01～0.02 mg/mL时，前者自由基抑制率低于后者；随浓度增大为0.04～0.16 mg/mL时，后者自由基清除率低于前者；当蓝莓酒渣花色苷浓度达0.08 mg/mL时，羟自由基清除率达66.54%；浓度达0.16 mg/mL时，羟自由基清除率达82.40%。 综合分析以上3组试验结果可知，蓝莓酒渣花色苷具有较好抗氧化能力，与25%蓝莓花色素苷标准品抗氧化能力接近。
3结论
在单因素试验基础上，通过响应面分析法优化了蓝莓酒渣花色苷最佳提取工艺，建立了可靠的预测模型，得到蓝莓酒渣花色苷最优提取条件为：柠檬酸酸化70%乙醇（体积含量，pH值=3）为提取液，浸泡10 min，液料比33 mL ∶1 g、超声时间50 min、提取温度65 ℃、连续提取2次。此条件下蓝莓酒渣花色苷提取率为6.092 mg/g，与理论预测值基本一致。通过DPPH自由基清除能力、抗超氧自由基能力、羟自由基抑制能力测试发现，所提酒渣花色苷具有较强的抗氧化活性，0.16 mg/mL 的花色苷提取液对DPPH自由基清除率达8170%，抗超氧阴离子自由基能力达220.89 U/L，羟自由基抑制率为82.40%。由此可见，超声辅助提取的蓝莓酒渣花色苷得率较高、抗氧化能力较强，既为节能环保、提高蓝莓酒渣资源的利用率提供了很好的思路，又为蓝莓酒渣花色苷工业化生产提供了试验依据。
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