【摘 要】
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[目的]建立快速筛选猪的基因编辑阳性成纤维细胞系的方法以提高利用体细胞核移植产生基因编辑克隆猪的效率.[方法]通过PCR、T7EN1酶切和Sanger测序分析不同数量的已知猪基因编辑阳性细胞(20、50、100、150和200个细胞)的基因型,确定最小细胞数用于鉴定未知的基因编辑阳性细胞系以证明该方法的可行性.[结果]除20细胞组外,其他所有细胞组中均扩增出2条明显的T7EN1酶切条带(175和555 bp).定量数据显示:20细胞组和50细胞组之间的条带灰度值存在极显著差异(P＜0.01),因此50细胞
【机 构】
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云南省动物基因编辑与体细胞克隆技术重点实验室,云南昆明650201;云南省异种器官移植工程研究中心,云南昆明650201;云南农业大学动物医学院,云南昆明650201;云南省动物基因编辑与体细胞克隆技
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[目的]建立快速筛选猪的基因编辑阳性成纤维细胞系的方法以提高利用体细胞核移植产生基因编辑克隆猪的效率.[方法]通过PCR、T7EN1酶切和Sanger测序分析不同数量的已知猪基因编辑阳性细胞(20、50、100、150和200个细胞)的基因型,确定最小细胞数用于鉴定未知的基因编辑阳性细胞系以证明该方法的可行性.[结果]除20细胞组外,其他所有细胞组中均扩增出2条明显的T7EN1酶切条带(175和555 bp).定量数据显示:20细胞组和50细胞组之间的条带灰度值存在极显著差异(P＜0.01),因此50细胞可用于基因编辑阳性细胞系鉴定.利用CRISPR/Cas9系统构建IPO13打靶载体,转染猪胎儿成纤维细胞形成细胞克隆点后计数50个细胞来筛选阳性细胞系,再通过体细胞核移植快速生产了IPO13敲除猪,从而证实通过微量细胞鉴定快速生产基因编辑猪的可行性.筛选基因编辑阳性细胞系的一般方法大约需要33.7 d,新建立的方法细胞筛选周期仅为18.9 d(减少15d),获得阳性细胞系的成功率也提高了约4倍.[结论]本研究建立了一种通过微量细胞鉴定快速生产基因编辑克隆猪的方法,该方法可行可靠.
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