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[摘要] 目的 建立一种香菇多糖氯化钠注射液中香菇多糖含量的测定方法。 方法 以香菇多糖精制品为对照品，使用蒽酮-硫酸比色法测定。 结果 香菇多糖氯化钠注射液在（10.15～30.45） μg/mL范围内呈良好线性关系（r = 0.999 9），精密度RSD = 0.87%（n = 6），平均回收率为99.66%，RSD = 1.04%（n = 9）。 结论 本法简便、可行、准确，适用于香菇多糖氯化钠注射液中香菇多糖含量的测定。
[关键词] 香菇多糖氯化钠注射液；蒽酮-硫酸比色法；含量测定
[中图分类号] R927 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2012）30-0108-02
Determination of the lentinan content in lentinan and sodium chloride injection
LI Yulong
School of Pharmaceutical Sciences，Hainan Medical University，Haikou 571199，China
[Abstract] Objective To establish a method of determining the lentinan content in lentinan and sodium chloride injection. Methods To determine by anthrone-sulfuric acid colorimetry，taking lentinan product as the reference control. Results When the concentration of the lentinan and sodium chloride injection is between 10.15 μg/mL and 30.45 μg/mL，it shows positive linear relations（r = 0.999 9），with the precision RSD = 0.87%（n = 6） and average recovery rate of 99.66%，RSD = 1.04%（n = 9）. Conclusion This method is simple，feasible and accurate，so it can be applied to the determination of the lentinan content in lentinan and sodium chloride injection.
[Key words] Lentinan and sodium chloride injection；Anthrone-Sulfuric acid colorimetry；Content determination
香菇多糖氯化钠注射液有效成分为香菇多糖，其结构以β2（1→3）吡喃葡糖苷的结合为主链，又含有以β2（1→3）及β2（1→6）吡喃葡糖苷为分枝的β2（1→3）葡聚糖[1]。目前，国内外对香菇多糖的研究比较深入，测定方法也不断改进，主要有比色法、滴定法、高效液相色谱法等[2，3]。本文着重探讨蒽酮-硫酸法测定香菇多糖氯化钠注射液中香菇多糖含量的条件，并进行了方法学研究，证明该方法简便、可行、准确，可为产业化生产香菇多糖氯化钠注射液的质量控制提供依据。
1 材料与方法
1.1仪器
UV1700-型紫外可见分光光度计（日本岛津公司）RE-52A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），HH-S2S型恒温水浴锅（金坛市大地自动化仪器厂）。
1.2试药
香菇多糖对照品（含量为99.95%），香菇多糖氯化钠注射液（海南联合制药工业有限公司生产，规格：100 mL∶香菇多糖1 mg与氯化钠0.9 g，批号：050101、050102、050103）。
1.3试剂
氢氧化钠、硫酸、蒽酮、硝酸银、糊精、荧光黄、硫酸铜、无水碳酸钠、酒石酸钾钠、碳酸氢钠、酚酞、草酸钾、碘化钾、硫代硫酸钠、碘酸钾、淀粉均为市售分析纯。
2结果
2.1 测定波长的确定
取供试品2瓶，浓缩至约30 mL，加水分次转移至100 mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀。取新配制的蒽酮硫酸溶液（取0.2 g蒽酮溶于100 mL硫酸中）4 mL置于试管中，置冰浴中，沿管壁缓缓加入供试品溶液2 mL，分层后立即剧烈振摇，摇匀，置沸水浴中加热6 min，取出，立即置冰浴中冷却2 min，取出，摇匀，室温放置10 min；另取本品空白辅料（氯化钠）1.812 g，置于100 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，与供试品同操作。以水为空白，在波长为400～800 nm的波长范围内扫描，测定紫外吸收光谱图。结果显示，香菇多糖氯化钠注射液在625 nm处有最大吸收，空白辅料在此处无吸收。
2.2 测定方法的选择
参照香菇多糖注射液国家药品标准[WS-1071（X-806）-2002]，拟定试验方法为：取经五氧化二磷减压干燥至恒重的香菇多糖对照品约10 mg，精密称定，加0.5 mol/L氢氧化钠溶液10 mL，研磨，使溶解，加水分次转移至500 mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀。另取供试品2瓶，浓缩至约30 mL，加水分次转移至100 mL量瓶中，定容并摇匀。取新配制的蒽酮硫酸溶液（取0.2 g蒽酮溶于100 mL硫酸中）4 mL分别置于两试管中，冰浴中分别沿管壁缓缓加入供试品溶液和对照品溶液各2 mL，分层后立即剧烈振摇，摇匀，置沸水浴中加热6 min，取出，立即置冰浴中冷却2 min，取出，摇匀，室温放置10 min，照紫外-可见分光光度法（中国药典2005年附录Ⅳ A），以水为空白，在625 nm的波长处测定吸光度，计算。 2.3精密度试验
取新配制的蒽酮硫酸溶液4 mL于试管中，置冰浴中，沿管壁缓缓加入供试品溶液2 mL，使分层，立即剧烈振摇，摇匀，置沸水浴中加热6 min，取出，立即置冰浴中冷却2 min，取出，摇匀，室温放置10 min，照紫外-可见分光光度法在625 nm波长处测定吸收度，重复测定6次，见表1。试验结果表明，RSD = 0.87% < 2.0%，可以满足含量测定的要求。
表1 精密度试验结果
2.4 重复性试验
取本品6瓶，分别浓缩至约20 mL，分别加水分次转移至50 mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀；照上述测定方法测定，见表2。试验结果表明，RSD = 1.29% < 2.0%，能满足本品含量测定的要求。
表2 重复性试验结果
2.5线性关系试验
精密称取干燥至恒重的香菇多糖对照品20.3 mg，加0.5 mol/L氢氧化钠溶液10 mL，研磨，使溶解，加水分次转移至500 mL容量瓶中，并稀释至刻度，摇匀（相对于含量测定浓度的200%）；分别精密量取上述溶液加水稀释制成含量测定浓度的50%、80%、100%、120%、150%，在冰浴条件下，分别精密量取上述溶液各2 mL，沿管壁缓缓加至已精密加入蒽酮硫酸溶液4 mL的试管中，使分层，立即剧烈振摇，摇匀，置沸水浴中加热6 min，取出，立即置冰浴中冷却2 min，取出，摇匀，室温放置10 min，照紫外-可见分光光度法以水为空白，在625 nm的波长处测定吸光度分别为0.181 6、0.294 2、0.371 5、0.440 6、0.552 7。
试验结果表明，香菇多糖在含量测定浓度的50%～150%范围内，吸光度与浓度呈现良好的线性关系（r = 0.999 9），可满足含量测定的要求。
2.6回收率试验
取干燥至恒重的香菇多糖对照品约8 mg、10 mg、12 mg（注：每个称三份），加0.5 mol/L氢氧化钠溶液10 mL，研磨，使溶解，分别加水分次转移至已加入工艺比例混合的空白辅料的500 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。按（2.1.2）方法测定本品的回收率，见表3。实验结果表明：选定的含量测定法平均回收率为99.66%，回收率均在98.0%～102.0%范围，RSD = 1.04% < 2.0%，结果良好，可以满足含量测定的要求。
表3 回收率试验结果
3讨论
实验结果表明，实验方法的重现性非常理想，蒽酮-硫酸法测定香菇多糖氯化钠注射液在（10.15～30.45） μg/mL范围内呈良好线性关系（r = 0.999 9），精密度RSD = 0.87%（n = 6），平均回收率为99.66%，RSD = 1.04%（n = 9）。经以上方法学考察认为，蒽酮-硫酸法测定香菇多糖氯化钠注射液中香菇多糖的含量较稳定、可靠。
3.1 香菇多糖含量测定方法的选择
本实验主要成果是成功地运用蒽酮-硫酸法测定出香菇多糖氯化钠注射液中香菇多糖的含量。
3.2 减少误差的方法
为了减少含量测定中存在的误差，在样品浓缩过程中应注意溶液暴沸及样品的析出，由于浓硫酸遇水放热，可能导致水解等一系列的反应迅速进行，因此选择较大的反应容器（25 mL纳氏比色管），并于冰水浴中加入后缓缓摇匀的操作，使置沸水浴中之前反应的发生尽可能小；同时要严格控制实验过程中加热时间是6 min，因为实验发现6 min是其反应的最高点，时间过短或太长都会影响测定结果。
3.3 反应灵敏度的影响
因样品中含有其他可能消耗碱性硫酸铜试剂的物质，而蒽酮-硫酸法所用的显色剂有特异性，仅与样品中特定的物质反应， 具有较高的灵敏度[4]。
3.4 供试品溶液浓度高低的选择
紫外-可见分光光度法测定供试品溶液的吸光度读数以0.3～0.7之间的误差较小，因此我们配制供试品溶液时要确保其吸光度在这个范围内。
通过实验的研究和总结，成功制订出了一种科学、合理、可行的测定香菇多糖氯化钠注射液含量的方法，为保证药物含量的可控性提供了有力依据。
[参考文献]
[1] 王国佳，曹红. 香菇多糖的研究进展[J]. 解放军药学学报，2011，27（05）：451-455.
[2] 韦丁，陈健. 香菇多糖含量测定过程中加样回收率的比较[J]. 食品研究与开发，2010，31（10）：155-157.
[3] 范晓良，颜继忠，阮伟峰. 香菇多糖的提取、分离纯化及结构分析研究进展[J]. 海峡药学，2012，24（5）：1-4.
[4] 王国佳，曹红. 香菇多糖中药注射液含量测定方法的改进[J]. 解放军药学学报，2012，28（2）：139-140.
（收稿日期：2012-09-18）
[关键词] 香菇多糖氯化钠注射液；蒽酮-硫酸比色法；含量测定
[中图分类号] R927 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2012）30-0108-02
Determination of the lentinan content in lentinan and sodium chloride injection
LI Yulong
School of Pharmaceutical Sciences，Hainan Medical University，Haikou 571199，China
[Abstract] Objective To establish a method of determining the lentinan content in lentinan and sodium chloride injection. Methods To determine by anthrone-sulfuric acid colorimetry，taking lentinan product as the reference control. Results When the concentration of the lentinan and sodium chloride injection is between 10.15 μg/mL and 30.45 μg/mL，it shows positive linear relations（r = 0.999 9），with the precision RSD = 0.87%（n = 6） and average recovery rate of 99.66%，RSD = 1.04%（n = 9）. Conclusion This method is simple，feasible and accurate，so it can be applied to the determination of the lentinan content in lentinan and sodium chloride injection.
[Key words] Lentinan and sodium chloride injection；Anthrone-Sulfuric acid colorimetry；Content determination
香菇多糖氯化钠注射液有效成分为香菇多糖，其结构以β2（1→3）吡喃葡糖苷的结合为主链，又含有以β2（1→3）及β2（1→6）吡喃葡糖苷为分枝的β2（1→3）葡聚糖[1]。目前，国内外对香菇多糖的研究比较深入，测定方法也不断改进，主要有比色法、滴定法、高效液相色谱法等[2，3]。本文着重探讨蒽酮-硫酸法测定香菇多糖氯化钠注射液中香菇多糖含量的条件，并进行了方法学研究，证明该方法简便、可行、准确，可为产业化生产香菇多糖氯化钠注射液的质量控制提供依据。
1 材料与方法
1.1仪器
UV1700-型紫外可见分光光度计（日本岛津公司）RE-52A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），HH-S2S型恒温水浴锅（金坛市大地自动化仪器厂）。
1.2试药
香菇多糖对照品（含量为99.95%），香菇多糖氯化钠注射液（海南联合制药工业有限公司生产，规格：100 mL∶香菇多糖1 mg与氯化钠0.9 g，批号：050101、050102、050103）。
1.3试剂
氢氧化钠、硫酸、蒽酮、硝酸银、糊精、荧光黄、硫酸铜、无水碳酸钠、酒石酸钾钠、碳酸氢钠、酚酞、草酸钾、碘化钾、硫代硫酸钠、碘酸钾、淀粉均为市售分析纯。
2结果
2.1 测定波长的确定
取供试品2瓶，浓缩至约30 mL，加水分次转移至100 mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀。取新配制的蒽酮硫酸溶液（取0.2 g蒽酮溶于100 mL硫酸中）4 mL置于试管中，置冰浴中，沿管壁缓缓加入供试品溶液2 mL，分层后立即剧烈振摇，摇匀，置沸水浴中加热6 min，取出，立即置冰浴中冷却2 min，取出，摇匀，室温放置10 min；另取本品空白辅料（氯化钠）1.812 g，置于100 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，与供试品同操作。以水为空白，在波长为400～800 nm的波长范围内扫描，测定紫外吸收光谱图。结果显示，香菇多糖氯化钠注射液在625 nm处有最大吸收，空白辅料在此处无吸收。
2.2 测定方法的选择
参照香菇多糖注射液国家药品标准[WS-1071（X-806）-2002]，拟定试验方法为：取经五氧化二磷减压干燥至恒重的香菇多糖对照品约10 mg，精密称定，加0.5 mol/L氢氧化钠溶液10 mL，研磨，使溶解，加水分次转移至500 mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀。另取供试品2瓶，浓缩至约30 mL，加水分次转移至100 mL量瓶中，定容并摇匀。取新配制的蒽酮硫酸溶液（取0.2 g蒽酮溶于100 mL硫酸中）4 mL分别置于两试管中，冰浴中分别沿管壁缓缓加入供试品溶液和对照品溶液各2 mL，分层后立即剧烈振摇，摇匀，置沸水浴中加热6 min，取出，立即置冰浴中冷却2 min，取出，摇匀，室温放置10 min，照紫外-可见分光光度法（中国药典2005年附录Ⅳ A），以水为空白，在625 nm的波长处测定吸光度，计算。 2.3精密度试验
取新配制的蒽酮硫酸溶液4 mL于试管中，置冰浴中，沿管壁缓缓加入供试品溶液2 mL，使分层，立即剧烈振摇，摇匀，置沸水浴中加热6 min，取出，立即置冰浴中冷却2 min，取出，摇匀，室温放置10 min，照紫外-可见分光光度法在625 nm波长处测定吸收度，重复测定6次，见表1。试验结果表明，RSD = 0.87% < 2.0%，可以满足含量测定的要求。
表1 精密度试验结果
2.4 重复性试验
取本品6瓶，分别浓缩至约20 mL，分别加水分次转移至50 mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀；照上述测定方法测定，见表2。试验结果表明，RSD = 1.29% < 2.0%，能满足本品含量测定的要求。
表2 重复性试验结果
2.5线性关系试验
精密称取干燥至恒重的香菇多糖对照品20.3 mg，加0.5 mol/L氢氧化钠溶液10 mL，研磨，使溶解，加水分次转移至500 mL容量瓶中，并稀释至刻度，摇匀（相对于含量测定浓度的200%）；分别精密量取上述溶液加水稀释制成含量测定浓度的50%、80%、100%、120%、150%，在冰浴条件下，分别精密量取上述溶液各2 mL，沿管壁缓缓加至已精密加入蒽酮硫酸溶液4 mL的试管中，使分层，立即剧烈振摇，摇匀，置沸水浴中加热6 min，取出，立即置冰浴中冷却2 min，取出，摇匀，室温放置10 min，照紫外-可见分光光度法以水为空白，在625 nm的波长处测定吸光度分别为0.181 6、0.294 2、0.371 5、0.440 6、0.552 7。
试验结果表明，香菇多糖在含量测定浓度的50%～150%范围内，吸光度与浓度呈现良好的线性关系（r = 0.999 9），可满足含量测定的要求。
2.6回收率试验
取干燥至恒重的香菇多糖对照品约8 mg、10 mg、12 mg（注：每个称三份），加0.5 mol/L氢氧化钠溶液10 mL，研磨，使溶解，分别加水分次转移至已加入工艺比例混合的空白辅料的500 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。按（2.1.2）方法测定本品的回收率，见表3。实验结果表明：选定的含量测定法平均回收率为99.66%，回收率均在98.0%～102.0%范围，RSD = 1.04% < 2.0%，结果良好，可以满足含量测定的要求。
表3 回收率试验结果
3讨论
实验结果表明，实验方法的重现性非常理想，蒽酮-硫酸法测定香菇多糖氯化钠注射液在（10.15～30.45） μg/mL范围内呈良好线性关系（r = 0.999 9），精密度RSD = 0.87%（n = 6），平均回收率为99.66%，RSD = 1.04%（n = 9）。经以上方法学考察认为，蒽酮-硫酸法测定香菇多糖氯化钠注射液中香菇多糖的含量较稳定、可靠。
3.1 香菇多糖含量测定方法的选择
本实验主要成果是成功地运用蒽酮-硫酸法测定出香菇多糖氯化钠注射液中香菇多糖的含量。
3.2 减少误差的方法
为了减少含量测定中存在的误差，在样品浓缩过程中应注意溶液暴沸及样品的析出，由于浓硫酸遇水放热，可能导致水解等一系列的反应迅速进行，因此选择较大的反应容器（25 mL纳氏比色管），并于冰水浴中加入后缓缓摇匀的操作，使置沸水浴中之前反应的发生尽可能小；同时要严格控制实验过程中加热时间是6 min，因为实验发现6 min是其反应的最高点，时间过短或太长都会影响测定结果。
3.3 反应灵敏度的影响
因样品中含有其他可能消耗碱性硫酸铜试剂的物质，而蒽酮-硫酸法所用的显色剂有特异性，仅与样品中特定的物质反应， 具有较高的灵敏度[4]。
3.4 供试品溶液浓度高低的选择
紫外-可见分光光度法测定供试品溶液的吸光度读数以0.3～0.7之间的误差较小，因此我们配制供试品溶液时要确保其吸光度在这个范围内。
通过实验的研究和总结，成功制订出了一种科学、合理、可行的测定香菇多糖氯化钠注射液含量的方法，为保证药物含量的可控性提供了有力依据。
[参考文献]
[1] 王国佳，曹红. 香菇多糖的研究进展[J]. 解放军药学学报，2011，27（05）：451-455.
[2] 韦丁，陈健. 香菇多糖含量测定过程中加样回收率的比较[J]. 食品研究与开发，2010，31（10）：155-157.
[3] 范晓良，颜继忠，阮伟峰. 香菇多糖的提取、分离纯化及结构分析研究进展[J]. 海峡药学，2012，24（5）：1-4.
[4] 王国佳，曹红. 香菇多糖中药注射液含量测定方法的改进[J]. 解放军药学学报，2012，28（2）：139-140.
（收稿日期：2012-09-18）