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【摘要】 目的：通过研究本院21株鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药基因和耐药情况，为临床用药提供依据。方法：用珠海迪尔DL-96微生物鉴定系统进行细菌鉴定及K-B法进行药敏试验，并用碳青霉烯酶4种基因的特异性引物对其进行聚合酶链反应(PCR)扩增和基因型分析，通过网上GemBank进行比对，以确定编码酶基因的类型。结果：21株鲍曼不动杆菌对左旋氧氟沙星、丁胺卡那霉素、多粘菌素B的耐药率分别为50%、25%、10%。其他抗生素的耐药率均在80%以上。携带D类碳青霉烯酶OXA-23基因有17株(81%)，携带OXA-51基因有15株(60%)，OXA-24、OXA-58基因引物PCR扩增为阴性，OXA-23基因阳性株进行测序后通过在网上GemBank比对与OXA-23标准株99%同源，OXA-51基因阳性株与OXA-51标准株98%同源。结论：鲍曼不动杆菌对多粘菌素的耐药率最低，其次是丁胺卡那霉素和左旋氧氟沙星，其中以携带OXA-23型碳青霉烯酶基因为主，应严格监测其耐药情况，针对性地选用抗生素，对防止其流行和多重耐药性的产生有着重要意义。
【关键词】 鲍曼不动杆菌； 碳青烯酶； 基因研究； 耐霉监测
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2012.20.089
鲍曼不动杆菌是一种分离率和耐药性最高的不动杆菌，是一种条件致病菌，也是重要的医院感染病原菌。近年来，由于广谱抗菌药物的滥用，多重耐药不动杆菌日趋增多，甚至出现多重耐药和全耐菌株，给临床治疗带来极大的困难。因为鲍曼不动杆菌在干燥物体表面生存时间可长达25 d以上，极易造成流行，给临床抗感染治疗带来很大的困难，也对院内感染的控制提出了新的要求[1]。鲍曼不动杆菌的耐药机制非常复杂，如产酶、PBP改变外膜蛋白缺失等因素有关。本文通过对21株对耐碳青霉烯类抗生素的鲍曼不动杆菌的耐药性和基因分析，进一步了解其耐药机制，为临床治疗和控制感染提供依据。
1 材料与方法
1.1 菌株来源 所有菌株均为从本院2009年1月-2011年1月住院患者痰液、血液、尿液等标本分离所得的非重复菌株，标准菌株为大肠ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853。
1.2 仪器与试剂 使用珠海迪尔DL-96微生物检测系统，药敏纸片由英国Oxoid购置，鉴定所用试剂购自珠海迪尔公司，MH、血培养基由江门凯林公司购置，电泳仪为Bio-Rad公司产品，PCR仪为美国PE公司产品，成像系统为英国UVI凝胶成像系统，Premix Taq酶及DNA Marker DL2000购自Takapa公司。
1.3 引物设计 参考相关文献[2]及参照GenBank中相关基因序列采用引物搜索软件oligo6.0合成引物，由上海英骏公司合成，引物序列及产物长度见表1。
1.4 检测方法
1.4.1 菌株鉴定 按照《全国临床检验操作规程》第3版规定采集和分离标本，经纯培养获得菌株后，进行革兰氏染色和生化试验等初筛，再进行鉴定。
1.4.2 药敏试验 按照《全国临床检验操作规程》第3版，用K-B纸片扩散法，检测菌株对常用抗菌药物的敏感性。并参照2007年美国临床实验室标准化研究所(CLSI)标准进行判断试验结果。
1.4.3 模板的制备 选取耐亚胺培南的鲍曼不动杆菌菌株接种在血平皿上，孵育18~24 h，再挑取数个菌落到EP管，加入灭菌蒸馏水150 μl，煮沸10 min立即冷却于4 ℃
12 000 r/min离心5 min，取上清液作为PCR模板，-20 ℃保存备用。
1.4.4 PCR扩增 采用PCR方法检测碳青霉烯类OXA基因，加入Premix Taq酶体系25 μl，上下游引物各1 μl，模板DNA10 μl，用ddH2O补足至50 μl。循环参数为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循环35次，最后72 ℃延伸10 min。取5 μl PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分析。
1.4.5 DNA序列分析 由上海英骏生物技术有限公司对PCR产物进行纯化及双向测序，测序结果直接在网上GenBank中进行blast比对同源分析，以确定基因型类别。
2 结果
2.1 21株耐亚胺培南鲍曼不动杆菌的分布特点 在21株菌中，以呼吸系统疾病检出的耐碳青霉烯类抗生素的鲍曼不动杆菌多见(76%)，其次是重症监护室(24%)。
2.2 21株亚胺培南耐药的鲍曼不动杆菌耐药性 在21株菌对14种药物的敏感试验结果中，左旋氧氟沙星的耐药率为50%，丁胺卡那霉素的耐药率为25%，多粘菌素B的耐药率最低为10%，其它抗菌素的耐药率都在80%以上，结果见表2。
表2 鲍曼不动杆菌对14种抗生素的敏感性试验结果
2.3 PCR扩增结果 分别采用4对特异性引物(OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58)对21株菌进行PCR扩增和电泳，结果表明，有17株(81%)OXA-23引物扩增阳性，见图1，PCR产物经双向测序后与网上GenBank上OXA-23序列号为GQ849192的鲍曼不动杆菌99%同源，有14株OXA-51引物扩增阳性，见图2。PCR产物经双向测序后与网上GenBank上OXA-51序列号为GQ525851的鲍曼不动杆菌98%同源。本研究所用的21株菌株中，未扩增到OXA-24和OXA-58型基因。
3 讨论
鲍曼不动杆菌一种条件致病菌，在呼吸道感染多见，也可引起败血症和泌尿道及伤口感染、继发性脑膜炎、术后感染等疾病。随着抗生素的广泛使用，鲍曼不动杆菌对许多抗生素表现出一定的耐药性。近年来，鲍曼不动杆菌已成为继铜绿假单细胞菌之后非发酵菌中的重要临床分离菌。由于碳青霉烯类抗生素有比其他抗菌药物更高效、更耐酶、更广谱的抗菌作用，因此目前已成为临床上治疗院内严重感染、混合感染、多重耐药菌感染的有效抗菌药物。但是，每出现新的一类抗菌药物，总是伴随着细菌新的耐药性形成。近年来，有关碳青霉烯类抗生素耐药的鲍曼不动杆菌的报道越来越多，甚至引起医院内感染的流行暴发，且预后较差[3]。 据报道，我国耐亚胺培南的鲍曼不动杆菌在2001年耐药率为3%，2002年为4.3%，到2008年上升到10.0%[4]。本研究发现，鲍曼不动杆菌一旦对亚胺培南产生耐药，对其他常用广谱抗菌药物的耐药率往往也比较高。从表2看出，除左旋氧氟沙星的耐药率为50%，丁胺卡那霉素耐药率为25%，多粘菌素B的耐药率为10%，其他常用抗生素的耐药率均在80%以上，有的抗生素的耐药性更为100%。这给临床治疗疾病带来极大困难。
不动杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制主要是产生碳青霉烯酶，这类酶是一类β-内酰胺酶，能够水解亚胺培南或美罗培南，包括Ambler分子分类中的A、B、D类酶[5]，D类酶分4组，每一组是OXA-23，包括OXA-23、27、49，其同源性为99%。第二组为OXA-24，包括OXA-25、26、40，其同源性为98%。第三组为OXA-51类，包括OXA-51、69，是天然产生的。第四组为OXA-58与其它3组的同源性(50%)[6]。在本研究的21株耐亚胺培南鲍曼不动杆菌分析结果中，OXA-23类基因检出率达81%，OXA-51类基因检出率达60%，未检出OXA-24和OXA-58类基因，这说明鲍曼不动杆对碳青霉烯酶类抗菌药物的耐药机制主要是产生OXA-23型碳青霉烯酶，且以OXA-23/OXA-51样基因为主，这与国内研究结果一致[7]。
近年来，随着抗生素的广泛应用，鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药率呈明显上升趋势，因其耐药机制复杂，甚至出现全耐药的情况，这已严重威胁临床对感染疾病的治疗。因此，了解鲍曼不动杆菌流行病学和抗药机制，严格监测其对药物的敏感情况，有针对性地选用抗生素，对防止鲍曼不动杆菌感染和流行及多重耐药情况的产生有着极大的意义。
参考文献
[1] Esen S，Leblebicioglu H.Prevalence of no socomial infections at intensive care units in Turkey：a multicentre 1-day point prevalence study [J].Scand J Infect Dis，2004，36 (2)： 14.
[2] Haluk V，Fatma B，Murat K，et al.High prev alence o f OXA-51-ty peclass D -lactamases among cefta zidim eresistant clinical isolates of Acinetobacter spp.：co-existence with OXA-58 in multiple centres [J].J Antimicrob Chemother，2006，58(3)：537.
[3] 史俊艳，张小江，徐春英，等. 2007 年中国CHINET 鲍曼不动杆菌耐药性监测[J].中国感染与化疗杂志，2007，9(3)：196-200.
[4] 廖晚珍，夏国际，彭卫华，等.耐碳青霉烯类抗生素鲍曼不动杆菌的基因检测与临床意义[J].临床检验杂志，2007，25 (6) ：456-457.
[5] 侯天文，尹晓琳，李玮，等.多重耐药鲍曼不动杆菌相关耐药基因检测分析[J].中华微生物学和免疫学杂志，2007，27(4)：379-383.
[6] 沈定霞，闫中强，罗燕萍，等.检测多药耐药鲍曼不动杆菌的碳青霉烯酶及整合酶基因[J].中华医院感染学杂志，2008，18(1)：11-13.
[7] 裘莉佩，潘登，徐炜烽，等.鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶基因型及分子流行病学研究[J].中华流行病学杂志， 2007，28(4)：381-384.
(收稿日期：2012-04-05) (本文编辑：陈丹云)
【关键词】 鲍曼不动杆菌； 碳青烯酶； 基因研究； 耐霉监测
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2012.20.089
鲍曼不动杆菌是一种分离率和耐药性最高的不动杆菌，是一种条件致病菌，也是重要的医院感染病原菌。近年来，由于广谱抗菌药物的滥用，多重耐药不动杆菌日趋增多，甚至出现多重耐药和全耐菌株，给临床治疗带来极大的困难。因为鲍曼不动杆菌在干燥物体表面生存时间可长达25 d以上，极易造成流行，给临床抗感染治疗带来很大的困难，也对院内感染的控制提出了新的要求[1]。鲍曼不动杆菌的耐药机制非常复杂，如产酶、PBP改变外膜蛋白缺失等因素有关。本文通过对21株对耐碳青霉烯类抗生素的鲍曼不动杆菌的耐药性和基因分析，进一步了解其耐药机制，为临床治疗和控制感染提供依据。
1 材料与方法
1.1 菌株来源 所有菌株均为从本院2009年1月-2011年1月住院患者痰液、血液、尿液等标本分离所得的非重复菌株，标准菌株为大肠ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853。
1.2 仪器与试剂 使用珠海迪尔DL-96微生物检测系统，药敏纸片由英国Oxoid购置，鉴定所用试剂购自珠海迪尔公司，MH、血培养基由江门凯林公司购置，电泳仪为Bio-Rad公司产品，PCR仪为美国PE公司产品，成像系统为英国UVI凝胶成像系统，Premix Taq酶及DNA Marker DL2000购自Takapa公司。
1.3 引物设计 参考相关文献[2]及参照GenBank中相关基因序列采用引物搜索软件oligo6.0合成引物，由上海英骏公司合成，引物序列及产物长度见表1。
1.4 检测方法
1.4.1 菌株鉴定 按照《全国临床检验操作规程》第3版规定采集和分离标本，经纯培养获得菌株后，进行革兰氏染色和生化试验等初筛，再进行鉴定。
1.4.2 药敏试验 按照《全国临床检验操作规程》第3版，用K-B纸片扩散法，检测菌株对常用抗菌药物的敏感性。并参照2007年美国临床实验室标准化研究所(CLSI)标准进行判断试验结果。
1.4.3 模板的制备 选取耐亚胺培南的鲍曼不动杆菌菌株接种在血平皿上，孵育18~24 h，再挑取数个菌落到EP管，加入灭菌蒸馏水150 μl，煮沸10 min立即冷却于4 ℃
12 000 r/min离心5 min，取上清液作为PCR模板，-20 ℃保存备用。
1.4.4 PCR扩增 采用PCR方法检测碳青霉烯类OXA基因，加入Premix Taq酶体系25 μl，上下游引物各1 μl，模板DNA10 μl，用ddH2O补足至50 μl。循环参数为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循环35次，最后72 ℃延伸10 min。取5 μl PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分析。
1.4.5 DNA序列分析 由上海英骏生物技术有限公司对PCR产物进行纯化及双向测序，测序结果直接在网上GenBank中进行blast比对同源分析，以确定基因型类别。
2 结果
2.1 21株耐亚胺培南鲍曼不动杆菌的分布特点 在21株菌中，以呼吸系统疾病检出的耐碳青霉烯类抗生素的鲍曼不动杆菌多见(76%)，其次是重症监护室(24%)。
2.2 21株亚胺培南耐药的鲍曼不动杆菌耐药性 在21株菌对14种药物的敏感试验结果中，左旋氧氟沙星的耐药率为50%，丁胺卡那霉素的耐药率为25%，多粘菌素B的耐药率最低为10%，其它抗菌素的耐药率都在80%以上，结果见表2。
表2 鲍曼不动杆菌对14种抗生素的敏感性试验结果
2.3 PCR扩增结果 分别采用4对特异性引物(OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58)对21株菌进行PCR扩增和电泳，结果表明，有17株(81%)OXA-23引物扩增阳性，见图1，PCR产物经双向测序后与网上GenBank上OXA-23序列号为GQ849192的鲍曼不动杆菌99%同源，有14株OXA-51引物扩增阳性，见图2。PCR产物经双向测序后与网上GenBank上OXA-51序列号为GQ525851的鲍曼不动杆菌98%同源。本研究所用的21株菌株中，未扩增到OXA-24和OXA-58型基因。
3 讨论
鲍曼不动杆菌一种条件致病菌，在呼吸道感染多见，也可引起败血症和泌尿道及伤口感染、继发性脑膜炎、术后感染等疾病。随着抗生素的广泛使用，鲍曼不动杆菌对许多抗生素表现出一定的耐药性。近年来，鲍曼不动杆菌已成为继铜绿假单细胞菌之后非发酵菌中的重要临床分离菌。由于碳青霉烯类抗生素有比其他抗菌药物更高效、更耐酶、更广谱的抗菌作用，因此目前已成为临床上治疗院内严重感染、混合感染、多重耐药菌感染的有效抗菌药物。但是，每出现新的一类抗菌药物，总是伴随着细菌新的耐药性形成。近年来，有关碳青霉烯类抗生素耐药的鲍曼不动杆菌的报道越来越多，甚至引起医院内感染的流行暴发，且预后较差[3]。 据报道，我国耐亚胺培南的鲍曼不动杆菌在2001年耐药率为3%，2002年为4.3%，到2008年上升到10.0%[4]。本研究发现，鲍曼不动杆菌一旦对亚胺培南产生耐药，对其他常用广谱抗菌药物的耐药率往往也比较高。从表2看出，除左旋氧氟沙星的耐药率为50%，丁胺卡那霉素耐药率为25%，多粘菌素B的耐药率为10%，其他常用抗生素的耐药率均在80%以上，有的抗生素的耐药性更为100%。这给临床治疗疾病带来极大困难。
不动杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制主要是产生碳青霉烯酶，这类酶是一类β-内酰胺酶，能够水解亚胺培南或美罗培南，包括Ambler分子分类中的A、B、D类酶[5]，D类酶分4组，每一组是OXA-23，包括OXA-23、27、49，其同源性为99%。第二组为OXA-24，包括OXA-25、26、40，其同源性为98%。第三组为OXA-51类，包括OXA-51、69，是天然产生的。第四组为OXA-58与其它3组的同源性(50%)[6]。在本研究的21株耐亚胺培南鲍曼不动杆菌分析结果中，OXA-23类基因检出率达81%，OXA-51类基因检出率达60%，未检出OXA-24和OXA-58类基因，这说明鲍曼不动杆对碳青霉烯酶类抗菌药物的耐药机制主要是产生OXA-23型碳青霉烯酶，且以OXA-23/OXA-51样基因为主，这与国内研究结果一致[7]。
近年来，随着抗生素的广泛应用，鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药率呈明显上升趋势，因其耐药机制复杂，甚至出现全耐药的情况，这已严重威胁临床对感染疾病的治疗。因此，了解鲍曼不动杆菌流行病学和抗药机制，严格监测其对药物的敏感情况，有针对性地选用抗生素，对防止鲍曼不动杆菌感染和流行及多重耐药情况的产生有着极大的意义。
参考文献
[1] Esen S，Leblebicioglu H.Prevalence of no socomial infections at intensive care units in Turkey：a multicentre 1-day point prevalence study [J].Scand J Infect Dis，2004，36 (2)： 14.
[2] Haluk V，Fatma B，Murat K，et al.High prev alence o f OXA-51-ty peclass D -lactamases among cefta zidim eresistant clinical isolates of Acinetobacter spp.：co-existence with OXA-58 in multiple centres [J].J Antimicrob Chemother，2006，58(3)：537.
[3] 史俊艳，张小江，徐春英，等. 2007 年中国CHINET 鲍曼不动杆菌耐药性监测[J].中国感染与化疗杂志，2007，9(3)：196-200.
[4] 廖晚珍，夏国际，彭卫华，等.耐碳青霉烯类抗生素鲍曼不动杆菌的基因检测与临床意义[J].临床检验杂志，2007，25 (6) ：456-457.
[5] 侯天文，尹晓琳，李玮，等.多重耐药鲍曼不动杆菌相关耐药基因检测分析[J].中华微生物学和免疫学杂志，2007，27(4)：379-383.
[6] 沈定霞，闫中强，罗燕萍，等.检测多药耐药鲍曼不动杆菌的碳青霉烯酶及整合酶基因[J].中华医院感染学杂志，2008，18(1)：11-13.
[7] 裘莉佩，潘登，徐炜烽，等.鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶基因型及分子流行病学研究[J].中华流行病学杂志， 2007，28(4)：381-384.
(收稿日期：2012-04-05) (本文编辑：陈丹云)