【摘 要】
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目的 研究p.Y225X突变对FOXL2功能的影响,探讨先天性小睑裂综合征(BPES)的可能发病机制.设计 实验研究.研究对象正常和p.Y225X突变的FOXL2基因.方法 克隆正常和p.Y225X突变的
【机 构】
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100730,首都医科大学附属北京同仁医院北京同仁眼科中心北京市眼科学与视觉科学重点实验室;国家人类基因组北方研究中心
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目的 研究p.Y225X突变对FOXL2功能的影响,探讨先天性小睑裂综合征(BPES)的可能发病机制.设计 实验研究.研究对象正常和p.Y225X突变的FOXL2基因.方法 克隆正常和p.Y225X突变的FOXL2基因编码序列,连接入绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1,构建融合绿色荧光蛋白的表达载体,转染COS7细胞,在共聚焦显微镜下比较正常和突变型FOXL2在细胞内定位的差异.将正常和突变基因的编码序列克隆入pcDNA3.1-myc-his(-)B真核表达载体,转染HEK-293T细胞和KGN细胞后提取蛋白,用蛋白印迹法验证其过表达；同时提取细胞RNA和蛋白,用RT-PCR和蛋白印迹法分别检测OSR2和StAR在RNA和蛋白水平的改变.主要指标荧光蛋白在细胞内的定位,目的RNA和蛋白的表达量.结果 成功构建了FOXL2及其突变体的绿色荧光蛋白融合表达质粒和融合myc/his标签的真核表达质粒,经蛋白印迹法验证了FOXL2及其突变体在HEK-293T和KGN细胞内的过表达.正常FOXL2均匀分布于细胞核内,而发生p.Y225X突变的FOXL2突变体蛋白则均匀分布于细胞质和细胞核中.正常FOXL2可降低KGN细胞内StAR的RNA和蛋白表达量,而p.Y225X突变使其对StAR转录表达的抑制作用明显减弱.正常FOXL2可提高HEK-293T细胞内OSR2的RNA和蛋白表达量,而突变型FOXL2对OSR2的促进作用明显减弱.结论 p.Y225X突变使FOXL2分子在细胞内异常定位于细胞质,对靶基因OSR2和StAR的调控作用减弱,可能是导致Ⅰ型BPES的重要因素.
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