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摘要：
目的：探讨通痹合剂治疗风湿及类风湿性关节炎的机理。方法：用完全佐剂造成大鼠关节炎模型，经通痹合剂治疗后，检测关节炎大鼠的足跖关节肿胀度，观察病变关节组织的炎症病理变化和血清中IL-6、NO含量的影响。结果：与正常对照组大鼠相比，RA模型大鼠关节组织中出现炎症病变，血清中IL-6、NO含量显著升高（P<0.05）， 与RA模型组相比通痹合剂高、低剂量组大鼠病变关节组织的炎症受到抑制关节肿胀度和血清中IL-6、NO含量和显著降低（P<0.05），但显著高于正常组（P<0.01），与阳性药正清风痛灵组无差异。结论：通痹合剂对完全佐剂造成的大鼠关节炎有抗炎消肿、改善病变关节组织的炎症状况、降低血清中IL-6、NO作用。
关键词：通痹合剂；抗炎消肿；IL-6；NO；完全佐剂；风湿性关节炎
【中图分类号】
R917 【文献标识码】B 【文章编号】1002-3763（2014）08-0010-01
通痹合剂是以治疗风湿及类风湿性关节炎为主的中药制剂，属通痹灵系列剂型之一。此药已在我院临床使用多年，疗效较佳。本实验根据通痹合剂舒筋活血、通络止痛等主要功效，观察其对完全佐剂造成的关节炎大鼠的病变关节组织的抗炎消肿和关节炎症组织形态的病理改善，及降低血清中IL-6、NO作用，了解通痹合剂治疗风湿及类风湿性关节炎的作用机理的实验研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物：清洁级SD大鼠，雄性、动物合格证号： 2001A046。动物购自广东省医学实验动物中心。
1.1.2 药物与试剂：（1）药物[1]。通痹合剂，批号020715，提供单位：广州中医药大学第一附属医院。2.正清风痛灵肠溶片，批号0009103，提供单位：湖南正清制药集团股份有限公司。（2）试剂与仪器：弗氏完全佐剂（adjuvant complete freund，美国Difco产品。）；一氧化氮试剂盒，购自南京建成生物工程研究所；IL-1放免试剂盒，购自北京东亚生物技术研究所。显微镜， 6010型紫外-可见分光光度计（惠普上分），BX40型显微镜日本 奥林巴斯公司。酶标仪 （BIO-RAD）model 550。
1.2 方法
1.2.1 AA大鼠模型的建立于大鼠右后足跖皮内注射完全弗氏佐剂0.1mL，诱发佐剂性关节炎[1]。
1.2.2 血清中白细胞介素IL-1 的检测：采用放免法：按试剂盒说明书上的方法测试。
1.2.3 血清中NO测定：比色分析法：按试剂盒说明书上的方法530nm处比色，测光密度。
1.2.4 实验分组及给药：大鼠试验前大鼠饲养三天后随机分为五组（1）正常组（2）正清风痛灵肠溶片组（48mg/kg/体重/日）（3）RA模型组（4）通痹合剂高剂量组（100%通痹灵合剂20g/kg/体重/日（5）通痹合剂低剂量组（50%通痹灵合剂20ml/kg/体重/日）。除正常组外，其余四组复制佐剂性大鼠关节炎模型，造模14天后测量大鼠右后肢体积（灌胃前），作为肿胀的初始体积指标。第15天后每组鼠分别按剂量灌胃连续给药8天，正常组和RA模型组给予等体积生理盐水。在造模后的第21天处死大鼠，测量各组大鼠致炎肢肿胀度（V灌胃后-V灌胃前），取血清检测IL-6、NO，然后做后肢关节病理切片检查。
1.5 血清中IL-6、NO检测：按试剂盒中说明书的方法进行检测。
1.6 统计学方法：采用SPSS软件统计，比较组间差异。
2 结果
2.1 一般外观观察：与正常组相比造模后的大鼠均出现程度不同的异常现象，如食量减少，毛色暗无光泽，自发活动减少，疲乏，消瘦等， RA模型组尤其严重。
2.2 通痹合剂对弗氏佐剂性关节炎大鼠血清中IL-6、NO的影响（x±s）
通痹灵合剂能显著降低弗氏佐剂性关节炎大鼠血清中IL-6、NO，其作用强度随剂量增大而增强（表1）。
4 病理观察
以上各组大鼠处死后剪后肢，剥皮，经甲醛固定，常规脱水，脱钙，做关节切片，染色后光镜下观察。结果如下：
与正常组相比：RA模型组软组织炎症严重，关节滑膜呈绒毛状增生， 绒毛间质內小血管增生明显，大量淋巴细胞及浆细胞浸润，局部见淋巴小结。通痹合剂高剂量组：滑膜病变和软组织炎症减轻，散见小血管增生及淋巴细胞及浆细胞浸润，未见淋巴小结.且个别治疗鼠表现为滑膜正常，软组织正常。 通痹合剂低剂量组，使滑膜病变和软组织炎症减轻。但治疗效果明显逊于通痹合剂高剂量组.正清风痛灵肠溶片治疗效果与通痹合剂高剂量组相比无明显差异.结果显示：，通痹合剂使佐剂造成关节炎大鼠的病变关节组织的炎症受到抑制，，使鼠关节病变组织趋于正常， 其疗效与正清风痛灵相比无差异。并对剂量存在依赖性.
5 讨论
类风湿关节炎（RA）是一种以关节滑膜慢性炎症为特征的自身免疫性疾病。多发于中老年人的慢性、进行性关节病，以关节滑膜呈绒毛状增生，炎性细胞浸润为主要病理特征[2]，而AA大鼠模型可表现出与RA极为相似的滑膜炎[3] 。近年来，有关细胞因子与滑膜病变的关系越来越引人注目， 在风湿及类风湿性关节炎的发生发展中发挥了重要作用的白介素 1（IL 1β），作为最早发现的炎症因子而日益受到重视[5]。正常数量的NO作为一种神经递质对于维持血管张力，抗血小板凝血的起着重要作用，过量的NO却造成细胞和组织的损害。在RA发病过程中，异常升高的NO则成为一种重要炎症介质直接参与关节损伤和炎症产生的过程，表现为血管过度扩张，渗出增加，并促进PGE2、TNF-A、IL-1A等炎症介质释放，加重炎症反应。降低NO，能减少其免疫损害和细胞毒性，起到抗炎免疫作用，有利于炎性肿胀的缓解。 风湿及类风湿性关节炎的病理变化主要为滑膜的破坏与变性，以及继发的滑膜与滑液炎症性改变，是滑膜分解与合成代谢失衡的结果。RA治疗的主要方向是延缓关节滑膜的退变改善滑膜与滑液炎症状况。通痹灵系列剂型之一的通痹合剂作为重要的祛风湿药长期以来广泛地应用于风湿性关节炎、骨关节炎等痹症的治疗，有“去众风，通十二经脉”的功效。通痹合剂可通过调节RA发生发展的关键性炎症因子IL 1水平产生对RA的防治作用以延缓关节滑膜的退变，改善病变关节组织的炎症状况。
病理学检查表明：消肿止痛，改善晨僵，抑制病情发展，促进关节功能恢复，对RA各期均有一定疗效， 能减轻关节滑膜的充血水肿、炎细胞浸润、滑膜细胞增生、组织增厚等渗出性变RA是一种免疫介导的炎症性疾病，其早期病变在节滑膜。AA大鼠模型可表现出与RA极为相似的关滑膜炎。现已了解，炎症细胞因子IL-1和NO在RA发病中相当重要。滑膜细胞合成的IL-1、NO等细胞因子释放入滑膜液和血液中，能促进滑膜成纤维胞的增殖和滑膜微血管的新生，是导致关节破坏的重因素。因此，减少IL-1、NO的含量是治疗RA的环节之一。
本实验表明：通痹合剂能能减AA大鼠“关节的炎症肿胀，降低IL-1、NO水平，减轻炎症反应，其作用机理可能是通过抑制滑膜炎、抑制IL-1，NO异常过量分泌，起到了抗炎消肿抑炎的作用，病理学观察证实，灸治能减轻关节滑膜的充血水肿、炎细胞浸润、滑膜细胞增生、组织增厚等渗出性变。现已了解，炎症细胞因子IL-1和NO在RA发病中相当重要。滑膜细胞合成的IL-1、NO等细胞因子释放入滑膜液和血液中，能促进滑膜成纤维胞的增殖和滑膜微血管的新生，是导致关节破坏的重因素。因此，减少IL-1、NO的含量是治疗RA的重要环节之一。也是通痹合剂治疗RA的机理之一，它通过下调滑膜细胞异常升高的分泌细胞因子的功能，从而使关节炎大鼠滑膜细胞的过度增殖恢复正常，抑制滑膜炎症的产生与发展，达到治疗与类风湿关节炎目的
参考文献
[1]徐叔云主编.药理实验方法学[M].第2版.北京：人民卫生出版社出版，723.
[2]蒋明，朱力平，林孝义，主编风湿病学.北京：科学出版社，1995：840.
[3]马东来.大鼠佐剂性关节炎的诱导及其免疫异常研究[J].中国实验临床免疫杂志，1995，7（3）：13～17.
[4]于孟学。风湿性疾病患者滑膜培养上清液中IL-1，TNF及PGE2的动态观察[J]中国医学科学院学报1：BB#1：？QAX]：B9.
[5]田峰，等。通胶囊对.佐剂性关节炎大鼠的继发关节炎病变及免疫功能的影响[J].中国中药与临床，2004，5（4）：369-371.
目的：探讨通痹合剂治疗风湿及类风湿性关节炎的机理。方法：用完全佐剂造成大鼠关节炎模型，经通痹合剂治疗后，检测关节炎大鼠的足跖关节肿胀度，观察病变关节组织的炎症病理变化和血清中IL-6、NO含量的影响。结果：与正常对照组大鼠相比，RA模型大鼠关节组织中出现炎症病变，血清中IL-6、NO含量显著升高（P<0.05）， 与RA模型组相比通痹合剂高、低剂量组大鼠病变关节组织的炎症受到抑制关节肿胀度和血清中IL-6、NO含量和显著降低（P<0.05），但显著高于正常组（P<0.01），与阳性药正清风痛灵组无差异。结论：通痹合剂对完全佐剂造成的大鼠关节炎有抗炎消肿、改善病变关节组织的炎症状况、降低血清中IL-6、NO作用。
关键词：通痹合剂；抗炎消肿；IL-6；NO；完全佐剂；风湿性关节炎
【中图分类号】
R917 【文献标识码】B 【文章编号】1002-3763（2014）08-0010-01
通痹合剂是以治疗风湿及类风湿性关节炎为主的中药制剂，属通痹灵系列剂型之一。此药已在我院临床使用多年，疗效较佳。本实验根据通痹合剂舒筋活血、通络止痛等主要功效，观察其对完全佐剂造成的关节炎大鼠的病变关节组织的抗炎消肿和关节炎症组织形态的病理改善，及降低血清中IL-6、NO作用，了解通痹合剂治疗风湿及类风湿性关节炎的作用机理的实验研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物：清洁级SD大鼠，雄性、动物合格证号： 2001A046。动物购自广东省医学实验动物中心。
1.1.2 药物与试剂：（1）药物[1]。通痹合剂，批号020715，提供单位：广州中医药大学第一附属医院。2.正清风痛灵肠溶片，批号0009103，提供单位：湖南正清制药集团股份有限公司。（2）试剂与仪器：弗氏完全佐剂（adjuvant complete freund，美国Difco产品。）；一氧化氮试剂盒，购自南京建成生物工程研究所；IL-1放免试剂盒，购自北京东亚生物技术研究所。显微镜， 6010型紫外-可见分光光度计（惠普上分），BX40型显微镜日本 奥林巴斯公司。酶标仪 （BIO-RAD）model 550。
1.2 方法
1.2.1 AA大鼠模型的建立于大鼠右后足跖皮内注射完全弗氏佐剂0.1mL，诱发佐剂性关节炎[1]。
1.2.2 血清中白细胞介素IL-1 的检测：采用放免法：按试剂盒说明书上的方法测试。
1.2.3 血清中NO测定：比色分析法：按试剂盒说明书上的方法530nm处比色，测光密度。
1.2.4 实验分组及给药：大鼠试验前大鼠饲养三天后随机分为五组（1）正常组（2）正清风痛灵肠溶片组（48mg/kg/体重/日）（3）RA模型组（4）通痹合剂高剂量组（100%通痹灵合剂20g/kg/体重/日（5）通痹合剂低剂量组（50%通痹灵合剂20ml/kg/体重/日）。除正常组外，其余四组复制佐剂性大鼠关节炎模型，造模14天后测量大鼠右后肢体积（灌胃前），作为肿胀的初始体积指标。第15天后每组鼠分别按剂量灌胃连续给药8天，正常组和RA模型组给予等体积生理盐水。在造模后的第21天处死大鼠，测量各组大鼠致炎肢肿胀度（V灌胃后-V灌胃前），取血清检测IL-6、NO，然后做后肢关节病理切片检查。
1.5 血清中IL-6、NO检测：按试剂盒中说明书的方法进行检测。
1.6 统计学方法：采用SPSS软件统计，比较组间差异。
2 结果
2.1 一般外观观察：与正常组相比造模后的大鼠均出现程度不同的异常现象，如食量减少，毛色暗无光泽，自发活动减少，疲乏，消瘦等， RA模型组尤其严重。
2.2 通痹合剂对弗氏佐剂性关节炎大鼠血清中IL-6、NO的影响（x±s）
通痹灵合剂能显著降低弗氏佐剂性关节炎大鼠血清中IL-6、NO，其作用强度随剂量增大而增强（表1）。
4 病理观察
以上各组大鼠处死后剪后肢，剥皮，经甲醛固定，常规脱水，脱钙，做关节切片，染色后光镜下观察。结果如下：
与正常组相比：RA模型组软组织炎症严重，关节滑膜呈绒毛状增生， 绒毛间质內小血管增生明显，大量淋巴细胞及浆细胞浸润，局部见淋巴小结。通痹合剂高剂量组：滑膜病变和软组织炎症减轻，散见小血管增生及淋巴细胞及浆细胞浸润，未见淋巴小结.且个别治疗鼠表现为滑膜正常，软组织正常。 通痹合剂低剂量组，使滑膜病变和软组织炎症减轻。但治疗效果明显逊于通痹合剂高剂量组.正清风痛灵肠溶片治疗效果与通痹合剂高剂量组相比无明显差异.结果显示：，通痹合剂使佐剂造成关节炎大鼠的病变关节组织的炎症受到抑制，，使鼠关节病变组织趋于正常， 其疗效与正清风痛灵相比无差异。并对剂量存在依赖性.
5 讨论
类风湿关节炎（RA）是一种以关节滑膜慢性炎症为特征的自身免疫性疾病。多发于中老年人的慢性、进行性关节病，以关节滑膜呈绒毛状增生，炎性细胞浸润为主要病理特征[2]，而AA大鼠模型可表现出与RA极为相似的滑膜炎[3] 。近年来，有关细胞因子与滑膜病变的关系越来越引人注目， 在风湿及类风湿性关节炎的发生发展中发挥了重要作用的白介素 1（IL 1β），作为最早发现的炎症因子而日益受到重视[5]。正常数量的NO作为一种神经递质对于维持血管张力，抗血小板凝血的起着重要作用，过量的NO却造成细胞和组织的损害。在RA发病过程中，异常升高的NO则成为一种重要炎症介质直接参与关节损伤和炎症产生的过程，表现为血管过度扩张，渗出增加，并促进PGE2、TNF-A、IL-1A等炎症介质释放，加重炎症反应。降低NO，能减少其免疫损害和细胞毒性，起到抗炎免疫作用，有利于炎性肿胀的缓解。 风湿及类风湿性关节炎的病理变化主要为滑膜的破坏与变性，以及继发的滑膜与滑液炎症性改变，是滑膜分解与合成代谢失衡的结果。RA治疗的主要方向是延缓关节滑膜的退变改善滑膜与滑液炎症状况。通痹灵系列剂型之一的通痹合剂作为重要的祛风湿药长期以来广泛地应用于风湿性关节炎、骨关节炎等痹症的治疗，有“去众风，通十二经脉”的功效。通痹合剂可通过调节RA发生发展的关键性炎症因子IL 1水平产生对RA的防治作用以延缓关节滑膜的退变，改善病变关节组织的炎症状况。
病理学检查表明：消肿止痛，改善晨僵，抑制病情发展，促进关节功能恢复，对RA各期均有一定疗效， 能减轻关节滑膜的充血水肿、炎细胞浸润、滑膜细胞增生、组织增厚等渗出性变RA是一种免疫介导的炎症性疾病，其早期病变在节滑膜。AA大鼠模型可表现出与RA极为相似的关滑膜炎。现已了解，炎症细胞因子IL-1和NO在RA发病中相当重要。滑膜细胞合成的IL-1、NO等细胞因子释放入滑膜液和血液中，能促进滑膜成纤维胞的增殖和滑膜微血管的新生，是导致关节破坏的重因素。因此，减少IL-1、NO的含量是治疗RA的环节之一。
本实验表明：通痹合剂能能减AA大鼠“关节的炎症肿胀，降低IL-1、NO水平，减轻炎症反应，其作用机理可能是通过抑制滑膜炎、抑制IL-1，NO异常过量分泌，起到了抗炎消肿抑炎的作用，病理学观察证实，灸治能减轻关节滑膜的充血水肿、炎细胞浸润、滑膜细胞增生、组织增厚等渗出性变。现已了解，炎症细胞因子IL-1和NO在RA发病中相当重要。滑膜细胞合成的IL-1、NO等细胞因子释放入滑膜液和血液中，能促进滑膜成纤维胞的增殖和滑膜微血管的新生，是导致关节破坏的重因素。因此，减少IL-1、NO的含量是治疗RA的重要环节之一。也是通痹合剂治疗RA的机理之一，它通过下调滑膜细胞异常升高的分泌细胞因子的功能，从而使关节炎大鼠滑膜细胞的过度增殖恢复正常，抑制滑膜炎症的产生与发展，达到治疗与类风湿关节炎目的
参考文献
[1]徐叔云主编.药理实验方法学[M].第2版.北京：人民卫生出版社出版，723.
[2]蒋明，朱力平，林孝义，主编风湿病学.北京：科学出版社，1995：840.
[3]马东来.大鼠佐剂性关节炎的诱导及其免疫异常研究[J].中国实验临床免疫杂志，1995，7（3）：13～17.
[4]于孟学。风湿性疾病患者滑膜培养上清液中IL-1，TNF及PGE2的动态观察[J]中国医学科学院学报1：BB#1：？QAX]：B9.
[5]田峰，等。通胶囊对.佐剂性关节炎大鼠的继发关节炎病变及免疫功能的影响[J].中国中药与临床，2004，5（4）：369-371.