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脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是脑卒中里致残率和致死率较高的亚型。ICH后血肿机械性压迫致周围脑组织血液循环障碍、炎症反应、血脑屏障通透性改变、血肿分解代谢产物等可导致继发性脑损伤及严重的神经功能障碍。尽管多种具有抗氧化、抗炎或具有神经保护作用的药物或分子靶点在动物实验中显示了积极的治疗效果,但在临床脑出血治疗中真正发挥疗效的却不多。TRPV4通道是近年来发现的TRP家族成员之一,广泛分布于中枢神经系统,在人类位于12号染色体。低渗刺激、细胞肿胀、温度刺激、机械刺激、花生四烯酸代谢产物等信号可导致其激活,因此TRPV4通道被认为是感受内环境物理、化学信号变化的重要感受器。激活的TRPV4通道介导Ca2+内流并参与了病理生理情况下的多种调节活动,如:缺血缺氧导致的神经元凋亡、化学性急性肺损伤中的炎症反应、创伤性脑损伤引起的脑水肿等,但它在脑出血中的作用还未得到证实。已有证据表明经TRPV4通道介导的Ca2+内流诱发内质网钙库释放Ca2+,以Ca2+依赖式Ca2+释放(Ca2+induced Ca2+release,CICR)形式引起细胞内钙振荡,参与了生理、病理情况下钙振荡的形成,并在维持胞内钙稳态中发挥重要作用。众所周知,当各种病理性刺激导致内质网错误蛋白质合成过多、折叠障碍或钙库倾空时,将诱发内质网应激(endoplasmic reticulum stress)。内质网应激触发内质网未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)来恢复蛋白稳态,若内质网钙库慢性持续倾空或未折叠蛋白超载将转而引发细胞凋亡。脑出血是否可能导致TRPV4通道激活,并以CICR形式导致内质网钙库倾空从而诱发内质网应激反应并导致神经元凋亡将是我们探讨的重点。综上所述,本课题拟探讨TRPV4通道在脑出血中是保护性作用还是伤害性作用,然后论证TRPV4通道是否经CICR触发内质网应激通路导致神经元凋亡。第一部分TRPV4通道在小鼠脑出血中的作用及对神经元凋亡的影响目的探讨TRPV4通道在脑出血中是否发挥作用及对神经元凋亡有无影响方法1.分组假手术组、溶剂对照组、GSK1016790A(TRPV4激动剂)+ICH组、HC-067047(TRPV4阻断剂)+ICH组2.检测指标(1)western blot检测小鼠脑出血后血肿周围TRPV4通道的蛋白表达变化。(2)脑出血后立即(15分钟内)侧脑室给予不同剂量TRPV4通道激动剂或阻断剂,小鼠神经行为学功能检测(神经功能评分、抓绳试验)。(3)脑出血后不同时间点给予TRPV4阻断剂,观察小鼠神经行为学功能改变。(4)激动或阻断TRPV4通道,测脑血肿区及血肿周围区水肿含量改变(干/湿法)。(5)激动或阻断TRPV4通道血肿区及血肿周围神经元凋亡情况的检测(TUNEL法、nissl染色)。结果(1)在小鼠脑出血后TRPV4通道表达呈时间依赖性上调。脑出血后6h开始患侧脑组织中TRPV4蛋白表达逐渐增加,至24小时稳定达到最高,48h后开始逐渐下降。同时当检测给予激动剂/阻断剂组脑出血后患侧脑组织(24h)也与模型组相比有同样程度的TRPV4表达上调。这说明脑出血病理改变可刺激TRPV4表达上调。(2)脑出血后阻断TRPV4通道改善小鼠的神经行为学。脑出血后立即(15分钟内)给予不同剂量的TRPV4激动剂/阻断剂可以观察到剂量依赖性神经行为学改善。另外,我们发现脑出血后12h之前给予侧脑室注射TRPV4阻断剂可改善动物神经行为功能,12h之后改善效果不明显。(3)阻断TRPV4通道改善脑出血后继发性脑水肿的程度。脑出血后血肿周围细胞明显肿胀,进一步激活TRPV4通道水肿加重,阻断TRPV4通道则水肿减轻。(4)阻断TRPV4通道缓解脑出血后神经元的凋亡侧脑室给予TRPV4激动剂加重脑损伤和神经元凋亡,阻断TRPV4通道则缓解神经元凋亡。说明TRPV4通道参与了脑出血后神经元的凋亡活动。结论脑出血后表达上调的TRPV4通道在各种病理刺激下激活,进而导致了神经元的凋亡。阻断TRPV4通道可改善脑损伤及动物行为学改变。第二部分TRPV4通道经CICR诱导钙库倾空介导的内质网应激通路参与了小鼠脑出血神经元的凋亡目的探讨TRPV4的作用是否通过CICR引发内质网钙库倾空,及内质网应激后是否经PERK-CHOP-Bcl-2和/或IRE1-JNK通路导致神经元凋亡。方法1.分组1.1原代培养神经元control组、GSK1016790A组、无钙细胞外液+GSK1016790A组、无钙细胞外液+GSK1016790A组+Ca Cl2组、毒胡萝卜素+GSK1016790A组1.2小鼠脑出血模型假手术组、溶剂对照组、GSK1016790A+ICH组、HC-067047+ICH组、2-APB+ICH组、GSK1016790A+2-APB+ICH组、HC-067047组+2-APB+ICH组2.检测指标(1)MTT、TUNEL测GSK1016790A对原代皮层神经元有无兴奋性毒性(2)钙成像检测TRPV4通道的CICR反应(3)免疫共沉淀检对照组与模型组TRPV4与IP3R的结合情况(4)western blot测激动/阻断TRPV4通道内质网应激通路PERK-CHOP-Bcl-2通路和IRE1-JNK通路的变化(5)阻断IP3R后,western blot测TRPV4通道内质网应激通路PERK-CHOP-Bcl-2通路和IRE1-JNK通路的变化(6)阻断IP3R后,血肿周围神经元凋亡情况(nissl染色)结果1.低浓度GSK1016790A对培养的原代神经元无损伤。MTT及TUNEL检测发现GSK1016790A浓度从0.1μmol/L到10μmol/L,细胞存活率几乎无变化,而30μmol/L GSK1016790A可使细胞存活率下降可能与高浓度下药物的毒性作用有关。2.激活神经元上的TRPV4通道可以诱发CICR反应。正常细胞外液中,加入GSK1016790A可诱发两种形式的胞内钙升高变化轨迹。无钙细胞外液中,GSK1016790A无法引起胞内Ca2+升高,重新加入Ca2+胞内钙Ca2+升高;提前倾空内质网钙(毒胡萝卜素),GSK1016790A无法引起胞内Ca2+升高,说明激动TRPV4后,经TRPV4通道内流诱发内质网钙库释放,即CICR活动。3.小鼠脑出血后TRPV4通道与IP3R结合量增加。免疫共沉淀显示,生理情况下TRPV4与IP3R有结合;脑出血后TRPV4与IP3R的结合量增加。生理情况下TRPV4对IP3R有正性调节作用,脑出血后IP3R可能触发TRPV4通道的持续开放及内质网钙库的慢性、持续释放钙离子,从而诱发内质网应激。4.小鼠脑出血后TRPV4通道介导的神经元凋亡发生,与内质网应激通路PERK-CHOP-Bcl-2的激活相关,与IRE1-JNK通路不相关。脑出血后激活/阻断TRPV4通道内质网应激通路PERK-CHOP-Bcl-2激活/抑制,而IRE1-JNK通路中p-JNK表达无变化,说明TRPV4通道主要是经PERK-CHOP-Bcl-2导致神经元凋亡。5.阻断IP3R受体的功能,可以逆转脑出血后内质网应激通路的激活,改善神经元的凋亡。阻断IR3R后,内质网应激通路凋亡相关蛋白减少,nissl染色神经元凋亡减少,说明IP3R是TRPV4导致内质网应激与神经元凋亡通路中的重要环节。结论TRPV4经CICR引起内质网钙库倾空导致内质网应激通路PERK-CHOP-Bcl-2激活并参与了小鼠脑出血后神经元的凋亡。