毛竹瞬时表达相关体系建立及应用

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原生质体意味着数量的庞大、细胞状态接近、基因型高度同源。这些可以给研究植物特殊基因功能和调控机制的带来稳定的实验结果。对于一些有价值的植物特性,目前人们已经能够在不同的植物中熟练的运用原生质体作为实验材料来研究该植物特征的机理。应用亚细胞定位、双分子荧光互补、免疫共沉淀、和农杆菌侵染等不同的实验手段不断的对植物性状进行研究。并且随着技术的不断发展,更多更新更高效的技术会应用于对植物的遗传转化研究中去。如Crispr/Cas9技术,已经能够熟练的应用于玉米、水稻、拟南芥、烟草等的原生质体中进行定向的基因编辑研究。这将对于植物更深层次基因特性的探究提供了强有力的方法。在毛竹中有一些很显著的特征一直为大家所熟知,例如毛竹具有快速生长的特点,毛竹开花时间的不确定性,开花后毛竹就会死亡的特点等等。这些都强烈的吸引着大家对这些特征进行探究,试图解开其中的原因。但是就目前研究毛竹的进展而言,由于遗传转化体系还没有建立不能够获得稳定遗传的毛竹突变体植株。对于毛竹原生质体的应用也很少,并没有一个成熟、稳定和重复性好的毛竹原生质体转化体系来共大家使用。这些都很大程度阻碍了大家对毛竹的进一步研究。本文将从探究毛竹原生质体制备开始,完善毛竹原生质体的制备流程获得高效的方法,到进一步探究如何更好的利用毛竹原生质体作为实验材料进行实验研究的体系的建立和应用。为大家对于毛竹相关的研究提供了多种实验手段,为大家的实验提供的了有力的帮助。本文在探究瞬时转化相关体系建立及应用主的过程中主要得出了以下几个重要结论:(1)毛竹原生质体制备最适酶解液为:纤维素酶(RS)2.5%+离析酶(R-10)1.25%(2)毛竹原生质体酶解液最适渗透势浓度的甘露醇浓度为9%(3)毛竹原生质体最佳的原生质体酶解时间为7h(4)成功将瞬时转化载体CNX-RFP(内质网)、Man1-RFP(高尔基体)、NLS-Mcherry(细胞核)在毛竹原生质体进行亚细胞定位(5)成功将pK7FWG2双元表达载体转化进毛竹原生质体中,并验证连接上毛竹功能基因的pK7FWG2-V11也能工作(6)成功将RFP瞬时表达载体、GFP瞬时表达载体转入同一个毛竹原生质体中验证了毛竹原生质体可以进行不同载体的共转化(7)成功在毛竹原生质体中构建双分子荧光互补(BiFC)体系,并在探究中将pB4CYGW-IAA38、pB4NYGW-ARF40两个载体转化进毛竹原生质体,探究基因的互作情况(8)成功在毛竹原生质体中将pK7EGF2-IAA8、pGWB615-ARF40载体转化进毛竹原生质体,应用免疫共沉淀(CO-IP)体系进行验证基因的互作(9)成功验证Crispr/Cas9体系可以应用于毛竹原生质体,载体Crispr/Cas9-bamboo成功将失效的mGFP基因恢复成有荧光功能的GFP基因
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