珠江口特殊微生物群落结构、功能及其生态学特征

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珠江是中国第二大河流,它地处于亚热带。珠江三角洲(the Pearl River Delta)作为中国经济最发达的地区之一,近年来正经历高速的城市化和工业化进程。因此,大量的有机污染物如:多环芳烃(PAHs),多溴联苯醚(PBDEs),多氯联苯(PCBs),有机氯农药等在珠江口的各类环境介质中都有检测到存在。本研究主要选择PAHs和PBDEs作为珠江口典型污染物进行分析。通过分子生物学技术(主要有PCR-DGGE方法和克隆文库等方法)来研究珠江口沉积物中微生物群落与这两类污染物之间的相互作用关系。对于PAHs的研究主要集中在珠江口多环芳烃降解菌的分布与环境因子之间的相互作用以及PAHs降解菌的分离和降解特性研究;而PBDEs的研究更加关注十溴联苯醚(BDE-209)对珠江口沉积物微生物群落结构的影响。本研究的主要研究内容和结果如下:   1) PCR-DGGE分析珠江口萘双加氧酶基因多样性选取2009年8月份珠江口上游到下游四个站点的表层沉积物,进行了微生物群落结构研究。通过16S rRNA-DGGE分析发现四个站点中微生物组成差别较大,并且珠江口上游的微生物多样性低于下游。基于萘双加氧酶基因(ndo基因)的PCR-DGGE分析则表明珠江口上游和下游区域中的ndo基因多样性(站点A2和A14)高于珠江口中游(站点A10和B4)。为了进一步探讨环境因子与ndo基因分布的相关关系,典型对应分析(CCA)发现站点A2中ndo基因主要受NH4-N影响,站点A10主要与SiO3-Si相关,而站点A14则与盐度的相关性较高。   2)珠江口沉积物中微生物多环芳烃环化水解双加氧酶研究通过16S rRNA-DGGE方法首先对2010年8月份的珠江口沉积物中微生物群落结构进行分析。对16S rRNA-DGGE图谱中的优势条带经测序比对后发现:Gammaproteobacteria为珠江口沉积物中主要的微生物门类(22.14%);而Deltaproteobacteria次之占到总微生物群落组成的20.31%。可见,珠江口沉积物由Gram-negative菌占优势(79%)。然后,通过克隆文库方法分析了该区域中多环芳烃环化水解双加氧酶基因(PAH-RHD)多样性。系统进化分析发现该区域中Gram-negative菌的PAH-RHD基因(PAH-RHD[GN])主要与Ralstonia sp.U2中的nagAc基因或Pseudomonassp.9816-4中的nahAc基因相似;而站点A1中Gram-positive菌的PAH-RHD基因(PAH-RHD[GP])主要与Mycobacterium属中的nidA基因相似。分子多样性表明两类基因(PAH-RHD[GN]和PAH-RHD[GP])在珠江口上游的多样性要高于珠江口下游,而且PAH-RHD[GN]基因的分布范围要广于PAH-RHD[GP]基因。冗余分析(RDA)表明NH4-N、∑PAHs、pH、SiO3-Si和水深是影响珠江口PAH-RHD[GN]基因分布的关键环境因子。   3)珠江口沉积物中芴降解菌Rhodococcus sp.A2-3的分离鉴定及其降解特征从珠江口广州河段表层沉积物中分离到一株高效的芴降解菌A2-3。通过形态观察,生理生化分析和16S rRNA的分子生物学亲缘关系分析方法,将该菌株鉴定为红球菌属成员,命名为Rhodococcus sp.A2-3。菌株A2-3能利用萘,芴,芘,三联苯,水杨酸,乙酸,无水乙醚,甲醇,柠檬酸和4,4’-二溴联苯醚作为唯一碳源和能源进行生长。通过研究不同pH、盐度和初始芴浓度对菌株A2-3的芴降解能力分析得出:菌株A2-3是Rhodococcus属中降解芴能力最强的菌株,菌株A2-3能在7天内降解掉88.8%的0.4 g/L的芴,而能降解掉35.8%的0.8 g/L的芴。此外,该菌株在较广的酸性条件范围下具有强的芴降解能力,菌株A2-3在pH为5.5时仍能完全降解100 mg/L芴。而当NaCl浓度为10 g/L-40 g/L时菌株A2-3对100 mg/L芴的降解率能达到100%。通过碳源利用情况和GC-MS对代谢产物的分析推测菌株A2-3的代谢途径为:通过双加氧酶在1,2位号位进行起始的加氧反应,然后转化为水杨酸,最终转化为CO2和H2O。   4)基因工程菌Ecoli pET32a-PAH(RHD)的构建初探根据NCBI公布的PAH-RHD基因序列设计简并引物,以Rhodococcus sp.A2-3菌的基因组DNA为模板,PCR成功扩增获得了PAH-RHD基因。该基因全长1426bp。同源性分析表明此PAH-RHD基因编码的氨基酸序列与Rhodococcus sp.HA01中的氧芴双加氧酶α亚基相似性最高(同源性达到100%)。将此基因重组至原核表达载体pET32a,构建含PAH-RHD基因的重组表达质粒pET28a-PAH(RHD),并转化至大肠杆菌BL21(DE3)。然而,经IPTG诱导后并未获得PAH-RHD蛋白的表达。   5)十溴联苯醚对珠江口沉积物中微生物群落演替影响主要探讨了BDE-209对珠江口沉积物微生物群落结构影响。通过16SrRNA-DGGE方法分析发现珠江口微生物群落具有地域差别,环境因子(NH4-N,盐度和SiO3-Si)能够影响该区域微生物组成。室内试验发现:高浓度BDE-209能够促进站点A2和C1的微生物多样性,而降低站点C6的多样性。UPGMA分析和PCA分析表明站点A2和C1的微生物群落变化受BDE-209浓度驱动,而站点C6的微生物群落变化取决于培养时间。在100 mg/kg BDE209处理组,培养35天后,Firmicutes是站点A2和C1的优势微生物群落。该研究表明BDE-209对珠江口不同区域的沉积物微生物群落的影响效果不同。
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