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肝移植已成为各种良性终末期肝病及早期、中期肝癌有效的治疗方法,然而,急性排斥反应(acute rejection,AR)仍是肝移植术后主要的并发症之一。未成熟树突状细胞(immature dendritic cells,imDC)可诱导抗原特异性T细胞低反应性并延长移植器官的存活时间;但它可能在活体内复杂的微环境中接受成熟信号而被诱导成熟,甚至会加重排斥反应。具有免疫抑制功能的单基因修饰imDC的基础研究已证实可增强imDC诱导免疫耐受的能力,也表现出一定的局限性,未能达到理想的免疫耐受状态。本研究采用联合具有不同免疫抑制功能的双基因共同修饰imDC,以进一步提高imDC诱导免疫耐受的能力,从而获得受者的长期生存。目的联合FasL和TGF-β1基因共修饰大鼠骨髓来源的imDC,旨在进一步提高imDC诱导大鼠同种异体原位肝移植免疫耐受的能力,以延长受鼠生存期。方法1.建立改良的大鼠原位肝移植模型:在原二袖套法的基础上,采用快速切取供肝,一针法连续缝合肝上下腔静脉以及对出血点进行热止血等方法,进行120例大鼠原位肝移植,并观察术后存活率。2.建立大鼠原位肝移植急性排斥反应模型:大鼠原位肝移植分3种移植组合:SD→SD组(同基因对照组),SD→Wistar组及DA→Lewis组,每组合20例。分别于术后3、5、7和10 d各随机处死4只,观察外周血肝功能变化(ALT和TBIL)与肝脏病理改变,各组除外技术死亡的受鼠,将余受鼠留做生存分析。3.培养和诱导DA大鼠骨髓来源的DC,经形态学、免疫表型及功能鉴定确认后,将构建好的pIRES2-EGFP-hFasL和pIRES2-EGFP-hTGF-β1质粒共转染到imDC,检测hFasL和hTGF-β1的表达。4.将空载体转染的DA大鼠imDC分别从尾静脉注射(尾静脉注射组,20只)和腹腔注射(腹腔注射组,20只)至Lewis大鼠体内,两组分别于注射后第1d、2d、3d、5d及7d各时间点处死4只大鼠,取胸腺、脾脏、腹腔淋巴结、肝脏及肾脏组织行冰冻切片,于荧光显微镜下观察、计数并分析。5.行以DA大鼠为供体、近交系Lewis大鼠为受体的同种异体原位肝移植140例,随机均分为7组:未注射DC组(对照组)、mDC组、imDC组、空载体组、FasL组、TGF组及共转染组;分别于移植前5d每天给Lewis大鼠腹腔注射mDC、imDC、空载体转染的imDC、hFasL修饰的imDC、hTGF-β1修饰的imDC、hFasL和hTGF-β1共修饰的imDC各2×106个,于肝移植术后3d、7d、10d各处死4只,观察外周血肝功能变化(ALT和TBIL),肝脏病理改变,肝、脾及腹腔淋巴结凋亡情况,外周血清细胞因子情况,各组除去技术死亡的受鼠,将余下受鼠作生存分析,死亡时取肝脏行病理组织学检查。结果1.大鼠原位肝移植各主要操作步骤手术中位时间:供体手术20 min,供肝修整3 min,肝上下腔静脉吻合9 min,门静脉重建3 min,无肝期15 min,肝下下腔静脉重建3 min。手术成功率达96.7%,动物的3周存活率为94.2%。2. SD→SD组大鼠原位肝移植术后仅有极少量的单核细胞浸润,RAI评分0～3分,属非确定型急性排斥反应(或无急性排斥反应);SD→Wistar组3只(75%,3/4)受鼠移植肝脏病变逐渐加重,到7d时RAI评分为5～7分,属于中度的急性排斥反应,术后10d才出现重度的急性排斥反应;有1只(25%,1/4)大鼠移植肝脏急性排斥反应在10d时反而减轻,淋巴细胞的浸润有所减少;DA→Lewis组3d后移植肝脏病变均迅速加重,RAI评分均为8～9分。经各时间点多组秩和检验示:3d时,3组差异无统计学意义(P=0.173),其排斥反应无显著差异;5、7和10d时,3组差异均有统计学意义(P=0.008、P=0.006和P=0.010),DA→Lewis组排斥反应均最明显,SD→Wistar组次之,SD→SD组均最不明显。SD→SD组血清ALT、TBIL浓度随着时间延长,逐渐下降,10d已恢复正常;DA→Lewis组血清ALT、TBIL浓度术后随着时间的延长,呈进行性升高;SD→Wistar组血清ALT、TBIL浓度随着时间延长,升高相对较慢,10d时达到DA→Lewis组7d的水平(P=0.934,P=0.072)。SD→SD组可长期存活,不发生排斥反应;SD→Wistar组中位生存时间为16d,DA→Lewis组中位生存时间为8d,明显短于SD→Wistar组(P=0.000)。3.成功建立了体外大量培养、诱导及扩增大鼠骨髓来源DC的方法;经相差倒置显微镜、透射电镜、扫描电镜及流式细胞仪鉴定,证实所培养细胞为DC。形态学结果显示:DC形态不规则,细胞核大而偏位,细胞表面可见细长树枝状突起。免疫表型结果显示:mDC和imDC表面均表达表面分子OX62,而共刺激分子CD86在imDC呈低表达,在mDC呈高表达。混合淋巴细胞反应(MLR)结果显示:imDC刺激同种异体T淋巴细胞的能力明显弱于mDC(P=0.005)。pIRES2-EGFP-hFasL和pIRES2-EGFP-hTGF-β1质粒经基因测序显示其序列与Pubmed基因库的hFasL和hTGF-β1序列相符合;经PCR鉴定示在846bp和339bp处有明显的条带。荧光显微镜观察显示pIRES2-EGFP-hFasL和pIRES2-EGFP-h TGF-β1质粒转染imDC后可见绿色荧光。流式细胞仪检测转染后未影响其表面分子CD86和CD80的表达。转染后MLR显示,TGF组、FasL组及共转染组的imDC对T细胞的增殖反应均弱于imDC组(P=0.006、0.002及0.000);共转染组的增殖反应均明显弱于TGF组和FasL组(P=0.010及P=0.030)。ELISA检测TGF组和共转染组的TGF-β1表达明显高于其他组,但各组sFasL的表达差异无统计学意义。经Westen-Blot检测有FasL和TGF-β1蛋白表达。4.供体骨髓来源的imDC在受体内的移行及分布显示:尾静脉注射组,第1d肝脏内imDC数量最多,达(92.2±4.2)个,其次是脾脏(32.6±7.6)个,腹腔淋巴结最少,只有(3.7±2.0)个,随着时间延长,肝脏、脾脏及腹腔淋巴结的imDC数量均逐渐减少;胸腺的imDC数量逐渐增多,第5d最高,为(30.6±14.3)个。腹腔注射组计数显示,腹腔淋巴结为第1d脏器含imDC数量最多的器官,达(40.7±4.0)个,第2d达高峰(64.4±17.8)个,以后逐渐递减,在1d、2d、3d、5d均多于尾静脉注射组,其P值分别为0.000,0.000,0.000,0.003。腹腔注射组第1d肝脏imDC数量处于第2位,达(24.6±5.0)个,并逐渐递增,第5d达到峰值(33.6±15.5)个,在1d、2d、3d少于尾静脉注射组,差异有统计学意义,P值分别为0.000、0.000、0.005。腹腔注射组脾脏呈逐渐递增,第5d达峰值为(35.9±11.3)个,多于尾静脉注射组(P=0.000)。第5d,腹腔注射组胸腺imDC数量少于尾静脉注射组(P=0.001)。5. hFasL和hTGF-β1基因共修饰imDC诱导大鼠肝移植免疫耐受研究:肝脏病理示共转染组和TGF转染组术后仅有较少量的单核细胞浸润,RAI评分2～5分,属非确定型急性排斥反应到轻度急性排斥反应,10d开始出现肝细胞再生,有少量的中性粒细胞浸润。FasL组排斥反应为轻度到中度,7d时肝脏出现中性粒细胞浸润,10d出现大量中性粒细胞浸润致大量肝细胞破坏。经Kruskal-Wallis H检验示,3d时,7组差异有统计学意义(P=0.020)但各组肝脏排斥反应均属轻度,共转染组和TGF组的排斥反应均轻于FasL组;7d时,7组差异有统计学意义(P=0.001),共转染组排斥反应均轻于TGF组和FasL组;10d时,7组差异有统计学意义(P=0.001),共转染组排斥反应轻于TGF组和FasL组,TGF组轻于FasL组。肝功能示共转染组于7d时就已基本恢复正常,FasL组于7d时有所降低,但10d时反而升高, ALT及TBIL的浓度均高于共转染组(P=0.000,P=0.028);TGF组到10d时,肝功能已恢复正常,ALT及TBIL的浓度均低于FasL组(P=0.000,P=0.025),但与共转染组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。TUNEL显示FasL组的肝、脾及腹腔淋巴结中淋巴细胞凋亡指数与共转染组相比,差异均无统计学意义(P>0.05),但多于TGF组,差异均有统计学意义(P<0.05)。ELISA检测示,术后7d共转染组和TGF组的血清IL-1、IL-10及IL-12与FasL组相比,差异均有统计学意义(P<0.05);但共转染组和TGF组之间差异无统计学意义(P>0.05)。FasL组中位生存期20d与imDC组(23d)差异无统计学意义(P=0.335),而TGF组延长受鼠生存时间有限(48d);只有共转染组出现长期存活的受鼠(>90d),均长于FasL组和TGF组(P=0.000,P=0.001)。结论1.经改良的大鼠原位肝移植方法,手术时间短,成功率高,稳定可靠,建立了比较稳定的大鼠原位肝脏移植模型,适用于肝移植方面的基础研究。2.SD→Wistar组合的大鼠原位肝移植模型虽可产生急性排斥反应,但发展相对慢,且会出现自发性免疫耐受,因而并非肝移植急性排斥反应基础研究理想的动物模型;DA→Lewis组合的大鼠原位肝移植术后肝脏病理改变、肝功能的变化及生存时间均符合临床上肝移植术后急性排斥反应的特点,是研究肝移植急性排斥反应理想的动物模型。3.本实验能培养、诱导、扩增大量的DC。hFasL或hTGF-β1基因转染均能够获得有效的表达,转染后对imDC表型没有明显影响;可明显降低imDC对同种异体T淋巴细胞的反应性。联合FasL和TGF-β1基因转染的imDC在体外诱导同种异体免疫耐受的能力强于FasL或TGF-β1单基因转染。4.腹腔注射时imDC在体内的分布主要以主动迁移为主,速度相对慢,避免了尾静脉注射时大量imDC快速分布在肝脏,以及切除受体肝脏时其内的imDC丢失,该途径适于肝移植免疫耐受的基础研究。5.imDC、hFasL或hTGF-β1单基因修饰imDC均未能诱导同种异体大鼠肝移植长期存活; hFasL和hTGF-β1共转染的imDC诱导同种异体大鼠肝移植免疫耐受的能力显著增强,显著延长同种异体肝移植大鼠的生存期。