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微生物降解芳香族化合物,其关键性的第一步是化合物如何进入细胞内,这一过程往往是依靠特定的转运蛋白来完成。芳香酸代谢过程中,化合物进入微生物细胞一部分是通过AAHS家族(Aromatic Acid:H+Symporter Family)的转运蛋白的主动运输完成的。相比较微生物代谢途径的大量研究报道,关于转运蛋白的研究报道却少得多。大肠杆菌K-12可以利用3-羟基苯丙酸为唯一碳源生长,相关代谢基因己得到了功能鉴定,其中mhpT仅推测与3-羟基苯丙酸转运吸收相关,其转运功能和转运机理尚未进行研究证明。
本研究通过生物信息学分析,确定潜在的3-羟基苯丙酸转运蛋白MhpT属于AAHS家族,将其与绿色荧光蛋白融合表达,证明该转运蛋白定位于细胞质膜上。通过分子生物学手段敲除mhpT,在碱性条件下,敲除突变株丧失利用3-羟基苯丙酸为唯一碳源的生长能力,回补该基因,生长能力得到恢复,可知mhpT是大肠杆菌K-12利用3-羟基苯丙酸生长的必需基因。以14C标记的底物进行转运实验,发现MhpT专一性的转运3-羟基苯丙酸,不能转运3-羟基苯丙酸的结构类似物——3-羟基苯甲酸、苯甲酸和龙胆酸。用3-羟基苯丙酸的结构类似物进行底物竞争抑制实验,发现无论是羟基取代还是硝基取代对底物的转运皆没有明显的抑制作用。在MhpT中选取了4个氨基酸位点进行不同方向的定点突变,以研究活性位点与其结构和功能的关系。结果表明,跨膜疏水区极性位点Glu-27,2-3跨膜区间的保守位点Asp-75和8-9跨膜区间的位点Trp-276对3-羟基苯丙酸的转运起到关键作用。当Glu-27突变为天冬氨酸和Ala-272突变为组氨酸后,两个突变株仍具有转运活力,并且能利用3-羟基苯丙酸为唯一碳源进行生长。
本研究系统研究了尚未进行过功能鉴定的大肠杆菌K-12中MhpT蛋白的功能,首次证明了MhpT具有3-羟基苯丙酸转运蛋白功能,且专一性地转运3-羟基苯丙酸。同时,证明了由MhpT介导的转运活力,是3-HPP代谢的限制性步骤。丰富了微生物代谢芳香酸的理论基础,进一步加强了对3-HPP转运蛋白转运机理的认识。
本文还对Pseudomonas putida KT2440中潜在的粘糠酸内酯转运蛋白Mu1H1和Mu1H2进行了初步研究。通过生物信息学分析,证明了两个潜在的粘糠酸内酯转运蛋白都具有AAHS家族典型的12个α-螺旋跨膜结构。分别与绿色荧光蛋白融合表达,共聚焦显微镜观察,两者均定位在细胞膜上。使用生物合成的办法尝试自行制备粘糠酸内酯,分别表达邻苯二酚1,2-双加氧酶CatA和糠酸环化酶CatB,顺序催化邻苯二酚生成粘糠酸内酯。