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目的:林生地霉(Geotricumsivicola)为新近发现的一种罕见地霉。2002年,首次从巴西的果蝇和印度柞蚕幼虫身上分离出。同年,我科首次从一脓癣患儿皮损中分离得到一株林生地霉。2005年,我科又自一例中毒性表皮坏死松解症患者的血液中分离出一株林生地霉。李秀丽等对皮损分离株进行了初步的形态学观察和体外药敏试验。
本研究一方面通过对林生地霉血液分离株的形态学观察,进一步了解林生地霉的形态学特征与产孢方式,为临床上诊断林生地霉病提供指导;另一方面,应用氟康唑、伊曲康唑、特比奈芬三种常用抗真菌药物治疗系统性林生地霉感染小鼠,通过对试验小鼠中位生存时间和生存率以及心、肝、脾、肺组织的真菌逆培养阳性率和肾脏组织载菌量的检测来评价它们在小鼠体内抗林生地霉的活性,为临床上治疗系统性林生地霉感染提供依据。
方法:1DNA序列分析提取血液分离菌株DNA,PCR扩增其26SrDNA近5’端D1/D2区域,在DNA自动测序仪上直接双向测序确定碱基位点,通过GenBank/EMBL/DDBJ/PDB核酸序列数据库进行同源序列检索,通过系统树显示其亲缘关系。
2血液分离株的形态学观察2.1大体菌落观察取血液分离株置常温下复苏,3天后转种于SDA培养基,37℃和27℃温箱培养,每天观察菌落的生长情况。
2.2光镜观察:分别取其丝状型和酵母样型菌落标本置于载玻片上,10%KOH溶液溶解后,盖上盖玻片,光镜下观察。
2.3扫描电镜观察:取两个温度下培养一周的菌落标本,置于4%的戊二醛中固定,常规制片后在扫描电镜下观察。
2.4透射电镜观察:取两个温度下培养一周的菌落标本,置于2.5%的戊二醛中固定,常规制片后在透射电镜下观察。
3体内药敏试验3.1林生地霉系统感染动物模型的制作:取皮损分离株经复苏转种后的菌落,用无菌生理盐水制备成菌悬液,通过腹腔注射途径接种至应用环磷酰胺免疫抑制的小鼠。
3.2给药方法接种后2h开始给药,氟康唑、伊曲康唑、特比奈芬均为10mg/(kg.d),腹腔注射,1天1次,连续5天。
3.3生存观察连续观察小鼠接种后21天内的自然死亡情况,记录死亡日期和死亡只数。
3.4组织逆培养各脏器用组织研磨器研碎后挑取少许接种于沙堡氏试管培养基,37℃温箱培养。
3.5肾脏组织载菌量(CFU)的测定肾脏组织经研磨器研碎后,用无菌生理盐水稀释至1ml,取10μl组织悬液均匀涂布于平皿培养基表面,48小时后读取菌落数。
结果:1DNA序列分析结果血液分离株(Hebei-1)26SrDNAD1/D2区序列分析,与皮损分离株(Changzheng-1)比较有1个碱基的差异,与林生地霉模式菌株比较有4个碱基的差异,鉴定为林生地霉。基于26SrDNAD1/D2区序列分析的系统发育树,结果显示Hebei-1菌株与Changzheng-1的亲缘关系最近。
2大体菌落观察培养第2~3天,菌落开始生长,初为白色绒毛样、粉末样,1~2周后菌落均转变为乳酪样,其中37℃下培养的菌落转变较早。
3光镜下观察菌丝相时,光镜下可见丰富的分支分隔菌丝、成链的关节孢子和圆形、椭圆形小分生孢子。酵母相时,光镜下可见丰富的单生或串生的芽生孢子,少量的厚膜孢子、外生或内生的关节孢子,菌丝稀少。
4扫描电镜观察可见菌丝分支末端或侧面着生球形、棒状的分生孢子,末端凹陷。
5透射电镜观察可见分生孢子与菌丝分离时全壁断裂,另一端正在出芽。
6真菌逆培养结果氟康唑和伊曲康唑治疗组小鼠心肺组织真菌培养阳性率较特比萘芬治疗组和生理盐水对照组均低,有显著性差异。余下各组中同一脏器的真菌逆培养阳性率比较均无差异。
7肾脏组织载菌量伊曲康唑和氟康唑治疗组中小鼠的肾脏组织载菌量较特比萘芬治疗组和生理盐水对照组均有显著减少;特比萘芬治疗组中小鼠的肾脏组织载菌量较生理盐水对照组无显著性减少;氟康唑治疗组中小鼠的肾脏组织载菌量较伊曲康唑治疗组显著减少。
结论:1林生地霉血液株有丝状型和酵母样型两种菌落形态而皮损株只有酵母样型。链状排列的矩形关节孢子、椭圆形或圆形的小分生孢子以及单生或串生的芽生孢子、厚膜孢子和分支分隔菌丝,为林生地霉形态学特征;有芽殖、外生和内生节孢子,为其三种产孢类型。
2氟康唑、伊曲康唑在小鼠体内均具有良好的抗林生地霉活性,提高了小鼠生存率和心、肺组织的真菌清除率,降低了肾组织的载菌量,而特比萘芬无效;氟康唑清除小鼠肾组织菌数的能力明显高于伊曲康唑,但在提高小鼠生存率和降低组织真菌逆培养的阳性率方面,两者无明显差异。