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羊口疮病毒(Orfvirus,ORFV),属痘病毒科副痘病毒属,是羊传染性脓疱病(俗称羊口疮)的病原体。ORFV是一种双链DNA病毒,全长138kb,GC含量64%,有132个预测基因,其中病毒的复制、形态和结构主要由中间保守区域调节;而两端则为相对不保守的基因,这些基因常常与宿主选择、免疫逃避,免疫调节及病毒毒力等相关。病毒在靶细胞复制过程中,会刺激宿主产生多种细胞因子和趋化因子,参与免疫调节、抗病毒等作用。目前已鉴定了一些ORFV的毒性基因,包括IL-10,CBP,VEGF和干扰素(IFN)抗性基因等,其靶标主要为宿主的细胞因子、趋化因子、NF-κB信号途径和凋亡途径等。这些毒性因子的协同作用使ORFV具有很强的免疫调节作用。ORFV125蛋白是文献报道的第一个ORFV编码的凋亡相关蛋白,该蛋白定位于线粒体,能在体外抑制UV诱导的细胞凋亡。也可与Bik,Bim等一系列BH3-only蛋白结合,中和这些蛋白的促凋亡活性。本课题组前期初步研究发现ORFV119蛋白定位于线粒体,可抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡,但其具体的分子调控机制尚不清楚。因此,本研究拟对ORFV119蛋白的功能进行深入的研究,明确其调控宿主细胞凋亡的作用,并重点研究其发挥凋亡作用的具体途径和分子机制。本课题主要来源:国家自然科学基金(NO.31170147)下面分别对本课题的研究方法、研究内容和研究结论进行总结。研究方法:第一章中,主要利用CCK8细胞增殖实验、DAPI染色、TUNEL实验和流式细胞术检测等多种技术、从不同的角度验证ORFV119蛋白诱导细胞凋亡这一作用。第二章中主要采用Caspase激活/抑制实验和凋亡蛋白芯片技术初步探讨ORFV119诱导细胞凋亡的途径,之后通过Western blot和ELISA技术分析验证ORFV119蛋白诱导细胞凋亡过程中相关蛋白和细胞因子变化情况,进而阐明ORFV119蛋白诱导细胞凋亡的分子机制。研究内容:第一部分:ORFV119诱导细胞凋亡作用的验证在293T细胞中高表达ORFV119蛋白,不同时间点利用CCK8法检测细胞增殖情况;采用两种不同真核表达载体瞬时转染ORFV119蛋白,不同时间DAPI荧光染色后,激光共聚焦显微镜观察细胞核形态变化。转染119GFP和pEGFP-N1后24 h采用TUNEL法检测凋亡细胞DNA断裂情况。同时高表达ORFV119蛋白后24 h,AnnexinV-APC和7-AAD双染,流式细胞术检测凋亡细胞数。第二部分:ORFV119诱导细胞凋亡机制的研究首先高表达ORFV119蛋白后24 h和48 h,利用Caspase激活试剂盒检测ORFV119蛋白对不同Caspase成员的活化程度,初步探讨凋亡的分子机制。为了获得更多凋亡过程中蛋白或细胞因子的变化情况,进行了人凋亡蛋白芯片检测。之后在高表达ORFV119蛋白的24 h和48 h,应用Western blot和ELISA技术验证相应蛋白及细胞因子变化水平,进一步明确ORFV119诱导细胞凋亡的分子机制。研究结论:本研究通过DAPI荧光染色,流式细胞术,蛋白芯片,Western blot,ELISA等方法研究了羊口疮病毒ORFV119的分子功能及其对细胞凋亡的影响和相关分子机制。研究发现,ORFV119蛋白定位于线粒体;能抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡;其诱导细胞凋亡作用主要为:ORFV119蛋白可使线粒体表面的促凋亡蛋白Bax和Bak上升,线粒体膜通透性增强,释放细胞色素C和促凋亡蛋白Smac/Diablo;同时下调cIAP-2和Bcl-2两个抑制凋亡蛋白,激活Caspase9;释放的细胞色素C和活化的Caspase9、Apaf-1因子形成凋亡小体,导致下游Caspase3和PARP的活化使细胞发生凋亡。同时ORFV119蛋白也可激活Caspase8,再直接活化Caspase3使细胞凋亡,也可使BID活化为tBID通过线粒体途径发挥凋亡调控作用。本研究明确了 ORFV119蛋白诱导细胞凋亡的作用并阐明其分子机制,使羊口疮病毒未知基因功能的探索更进一步。这些结果有助于研究羊口疮病毒的致病机制和免疫机理,为疾病的预防和控制提供理论基础,同时为新疫苗和药物的开发提供参考资料。