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目的:随着核技术的发展与放射治疗在临床肿瘤治疗领域的广泛应用,如何有效防护急性辐射损伤已成为核安全领域的重要研究内容。本课题以小肠隐窝Bmi1+干细胞为主要研究对象,以其相对较高的辐射抗性与多向分化潜能为切入点,结合谱系示踪(lineage tracing)技术深入研究TP53诱导的糖酵解及凋亡调节蛋白(TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator,TIGAR)调节Bmi1+干细胞增殖的分子机制;探究TIGAR促进小鼠小肠辐射损伤修复并用于急性肠型放射病防护的可行性,从而为急性放射性肠损伤以及急性肠型放射病的防护提供新的思路。方法:采用肠系膜上动脉(SMA)注射TIGAR过表达腺病毒(Ad-Tigar-EGFP)的方法,实现外源性TIGAR在小肠黏膜层的过表达;Western blot技术检测TIGAR和GFP在肠黏膜层中的表达水平;采用HE染色技术,统计照射前后小肠隐窝数目和绒毛长度变化;Ki67免疫组织化学染色检测肠隐窝干细胞的增殖能力,分析TIGAR对受照肠隐窝干细胞活力的影响;观察X射线照射后小鼠生存状态,比较TIGAR过表达组与对照组小鼠存活率的差异;应用Ad-Tigar-EGFP体外转染肠隐窝类器官体(Organoids)的方法,探索TIGAR过表达对Organoids放射敏感性的影响;免疫荧光技术分析TIGAR过表达对受照Organoids增殖能力的影响;Western blot技术探索TIGAR与BMI1表达水平之间的相关性;采用谱系示踪技术检测Bmi1Cre ER/+;Rosa26m Tm G/+小鼠Organoids中Bmi1+干细胞及其子代细胞的增殖能力,明确TIGAR与Bmi1+干细胞的增殖之间的相关性。结果:(1)TIGAR蛋白主要分布于小肠,表达水平从十二指肠至回肠逐渐降低;SMA注射亚甲基蓝染料后,其主要集中分布于空肠与回肠部位,证实SMA法注射腺病毒的空间分布;外源性注射TIGAR过表达腺病毒可导致小鼠空肠、回肠TIGAR表达水平显著增加(P<0.05);(2)SMA注射Ad-Tigar-EGFP可缓解辐射诱导的小肠损伤,导致肠隐窝数目和绒毛长度较对照组显著增加(P<0.05);Ki67免疫组化染色结果表明Ad-Tigar-EGFP组的阳性染色细胞数多于Ad-EGFP组,即TIGAR促进了受照肠隐窝干细胞的增殖活性;通过对小鼠的生存率的统计发现,TIGAR过表达可提高全腹X射线照射小鼠的存活率;(3)免疫荧光技术证实Ad-Tigar-EGFP可在Organoids中稳定过表达长达6 d,峰值时间为转染后2-3 d;致死剂量X射线照射后2 d,对照组(Ad-EGFP)的Organoids出现大量死亡,照后5 d存活的Organoids几乎消失;与此相比,Ad-Tigar-EGFP组Organoids的存活率在各时间点均高于Ad-EGFP组,表明TIGAR过表达可在一定程度上降低经X射线照射后Organoids的死亡率,有效维持受照Organoids的增殖活性;Western blot检测不同肠段黏膜层TIGAR与BMI1的表达水平,发现TIGAR与BMI1在十二指肠与空肠高表达,经统计分析发现,两者表达水平呈相关性;采用谱系示踪技术检测10 Gy X射线照射后Organoids中Bmi谱系细胞的增殖情况,发现TIGAR过表达可促进受照隐窝类器官内Bmi1+干细胞的分化和增殖能力,从而促进Organoids的增殖。结论:相较于尾静脉、腹腔注射给药等方式而言,SMA注射TIGAR过表达腺病毒可有效减少首过效应,从而增加蛋白过表达效率。体内实验发现,外源性增加TIGAR蛋白表达可在一定程度上减轻X射线照射引起的小肠损伤、提高受照小鼠的生存率。体外实验采用Organoids培养体系及谱系示踪技术,阐明了TIGAR加速Bmi1+干细胞的增殖分化,进而促进肠隐窝辐射损伤修复的分子机制。本课题的创新性在于采用了肠系膜上动脉(SMA)注射腺病毒(Ad-Tiga-EGFP)的方式增加肠隐窝中TIGAR表达水平,并采用谱系示踪技术研究Bmi1Cre ER/+;Rosa26m Tm G/+小鼠肠隐窝中Bmi1+干细胞的增殖、分化。