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X型胶原(Collagen type X,Col X)是功能未知的胶原,它通常只存在于生长发育期的软骨内,由肥大软骨细胞合成,然后分泌到细胞外基质,分布在即将骨化的软骨基质内。X型胶原这种特异性合成、局限性分布、一过性存在的特征,引起了人们的强烈兴趣,但是它在软骨内成骨中作用至今没有统一的结论,这种现象的出现可能和缺乏有效地研究Col X的模型有关。鹿茸是一种可以周期性再生的骨质器官,其成骨方式与典型的软骨内成骨类似,但又有所不同,具体表现为增厚的间充质层,前软骨层,过渡区及软骨层,可以提供更多的研究细节。另一方面,鹿茸软骨内成骨可以形成血管化的软骨。已有研究表明,鹿茸的软骨血管化可能与Col X存在某种联系。因此,鹿茸可以作为一个良好的模型来探索Col X在成骨过程中的作用并揭示Col X与鹿茸软骨血管化之间的联系,本研究拟从离体和活体两方面来探索Col X在鹿茸成骨过程中的作用。离体方面:本研究设计了4条针对梅花鹿Col X基因的RNAi靶位点S1-S4,构建重组质粒后包装并收获慢病毒颗粒PlvthmS1-S4,qPCR和Western Blot检验发现S3的干扰效率最高为96.4%。随后的组织学研究中发现,Plvthm-S3感染组AP细胞诱导分化为软骨细胞的过程中,Col X表达下调可以明显抑制AP细胞向软骨细胞分化。当Col X表达异常时,软骨细胞基质发生变化,导致软骨细胞的死亡。另一方面,通过qPCR和Western Blot技术对鹿茸尖部的各个分层:间充质层、前软骨层、过渡区及软骨层中Col X的表达差异进行定量分析,发现Col X在鹿茸过渡区中的表达量最高,而此区域是鹿茸血管的形成中心。在软骨层中,Col X的表达集中于血管壁及其四周分化程度较低的软骨细胞的基质中。因此,Col X很可能是某种信号分子引导鹿茸中血管的新生。活体方面:首先,本研究在细胞和组织水平测试了两种不同的慢病毒载体Plvthm和Pll3.7对AP细胞和AP组织的不同感染效果,结果发现Plvthm系统能够在细胞及组织水平有效地将标记基因GFP导入干细胞中,因此确定利用Plvthm慢病毒系统进行鹿茸活体模型的构建。其次,本研究采集了3头仔鹿的生茸区骨膜,在离体条件下利用Plvthm-S3慢病毒将干扰小片段S3导入AP组织中的干细胞内并移植回供体鹿的皮内。但是,移植活体后的AP组织没有能够发育形成鹿茸,反而被自体吸收了。为了揭示自体吸收的原因,本研究从机械切割对AP组织的损伤、体外培养对AP组织诱导血管生成、体外培养对AP组织中干细胞的存活三方面探索了重吸收发生的原因。结果发现:机械切割会对AP组织造成一定程度的损伤,但不会影响AP组织的正常发育。AP组织中的干细胞可以通过外分泌途径诱导血管生成,进而保证移植组织的存活。长时间的体外培养(21天左右)可以导致AP组织中干细胞的分化,AP组织中的干细胞在离体培养体系中能自发分化为软骨细胞并形成骨化中心,在此过程中AP组织中Col X和VEGF的表达下调导致其丧失了诱导血管生成的能力。因此经过长时间体外培养的AP组织自体移植后,由于不能建立正常的循环系统进而导致移植组织的坏死,导致免疫系统的攻击,进而发生自体组织的重吸收。结论如下:1)Col X在鹿茸软骨内成骨过程中扮演着至关重要的作用,Col X参与构建软骨基质,Col X表达下调引起软骨细胞基质异常,导致软骨细胞的死亡,抑制AP细胞向软骨细胞分化;2)Col X主要表达于鹿茸尖部的过渡区的前软骨细胞基质、软骨区的血管壁及其四周分化程度较低的软骨细胞的基质中,因此Col X很可能是某种信号分子引导鹿茸中血管的新生;3)构建活体鹿茸研究模型,需要解决体外培养时AP组织中干细胞的分化问题。AP组织中的干细胞可以通过外分泌途径诱导血管生成,进而保证移植组织的存活。长时间的体外培养(21天左右)可以导致AP组织中干细胞的分化,AP组织中的干细胞在离体培养的条件下中能自发分化为软骨细胞并形成骨化中心,在此过程中AP组中Col X和VEGF的表达下调导致其丧失了诱导血管生成的能力。因此,经过长时间体外培养的AP组织自体移植后,由于不能建立正常的循环系统进而导致移植组织的坏死,引起免疫系统的攻击,进而发生自体组织的重吸收。