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目的:本研究旨在探讨可溶性卷曲相关蛋白1(soluble frizzled related protein1,Sfrp1)抑制Wnt/β-catenin信号通路活性对于老龄急性心肌缺血损伤的作用及分子机制;在动物水平上探讨外源导入Sfrp1能否作为基因治疗药物,具有抑制Wnt/β-catenin信号通路活性,改善心功能、降低心肌纤维化程度、抑制心肌细胞凋亡、减轻老龄心肌急性缺血损伤的作用;在细胞水平上探讨Sfrp1抑制Wnt/β-catenin信号通路活性,减轻心肌细胞凋亡,抑制心肌成纤维细胞增殖等相关分子机制;探讨Wnt/β-catenin信号通路相关基因单核苷酸多态性与心肌梗死的遗传易感性的关系,为心肌梗死的早期诊断和治疗提供科学依据。方法:第一部分:15月龄C57BL/6J小鼠,dsAAV9-Sfrp1经尾静脉注射至小鼠体内,待Sfrp1表达高峰时间点,建立小鼠急性心肌梗死模型,研究Sfrp1过表达对老龄小鼠急性心肌梗死后3天、7天心功能参数、心脏组织学改变、细胞外基质产生、心肌细胞凋亡及Wnt/β-catenin信号通路活性的影响。第二部分:dsAAV9-Sfrp1分别转染体外培养的H9c2心肌细胞和心肌成纤维细胞,待Sfrp1表达高峰时间点,建立H9c2心肌细胞缺氧/复氧模型(H/R)诱导细胞凋亡,利用TGF-β1刺激心肌成纤维细胞建立增殖模型,检测Sfrp1过表达抑制Wnt/β-catenin信号通路活性,对H9c2心肌细胞凋亡和线粒体凋亡途径的影响,及对心肌成纤维细胞增殖、胶原合成和向肌成纤维细胞分化能力的影响。第三部分:分别对Wnt/β-catenin信号通路相关基因SFRP1,CTNNB1,WISP1的单核苷酸多态性位点在465例心肌梗死患者和485例健康对照者中采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法和基因测序法进行基因分型,卡方检验比较SFRP1,CTNNB1,WISP1基因各基因型在病例组及对照组中的分布差异,单因素和多因素logistic回归分析计算比值比(OR)及95%置信区间(CI)。结果:第一部分:(1)心脏超声结果示Sfrp1过表达时,与相对应的心梗后3天、7天组相比,LVEDd值有所降低(P均<0.05),而Pwdth及FS值相对增加(P均<0.05);(2)HE染色结果显示Sfrp1过表达后,心肌梗死后3天的炎性细胞浸润情况减轻,心肌梗死后7天的心肌坏死及纤维组织增生症状均明显减轻。Masson染色结果显示Sfrp1过表达后,与相对应的心梗后3天、7天组相比梗死区胶原纤维均明显减少(P均<0.05);(3)免疫组化染色结果示Sfrp1过表达后,与相对应的心梗后3天、7天组相比心肌细胞外基质Col-1和Col-3表达都显著下调(P均<0.05);(4)Tunel法染色检测心肌细胞凋亡率,结果示Sfrp1过表达时,与相对应的心梗后3天、7天组相比,心肌细胞凋亡率均显著下调,分别为32.15±3.43 vs.21.76±2.22%、47.33±5.12%vs.23.34±2.86%(P均<0.05)。Western blot检测发现Sfrp1过表达,无论是在心肌梗死后3天还是7天,均可以抑制Bax的表达,并上调Bcl-2的表达(P均<0.05)。(5)Western bolt及Real time PCR检测发现在心肌梗死后3天、7天Wnt/β-catenin信号通路关键分子Dvl-1、β-catenin及Wisp1蛋白水平及mRNA水平表达均上调,且随心肌梗死后时间的推移,表达明显升高(P均<0.05)。当Sfrp1过表达时,无论是在心肌梗死后3天还是7天,均明显下调(P均<0.05)。第二部分:(1)AnnexinV-FITC/PI双染法检测结果示Sfrp1过表达减少了H/R诱导的H9c2心肌细胞凋亡比例,56.67±3.49vs.31.48±5.18%(P<0.05);Caspase-3/7活性的检测结果示与H/R组相比,Sfrp1过表达明显降低了Caspase-3/7活性(P<0.05);Western blot检测发现Sfrp1过表达,与H/R组相比,显著升高了Bcl-2/Bax蛋白表达比例及活化的Caspase-3蛋白表达水平(P均<0.05);然而当Wnt/β-catenin信号通路的特异性激活剂Licl同时作用时,抑制了Sfrp1抗细胞凋亡的作用。(2)MTT检测结果示Sfrp1过表达减少了TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞的增殖,MTT-OD值为0.532±0.062 vs.0.293±0.025(P<0.05);流式细胞仪检测增殖周期分布结果示与TGF-β1组相比,Sfrp1过表达明显增加G0/G1期、G2/M期的细胞百分比,分别为53.65±1.78 vs.63.61±1.96%、9.24±0.82 vs.11.80±0.25%,降低S期的百分比37.42±0.78 vs.24.57±0.66%(P均<0.05);ELISA检测结果示与TGF-β1组相比,Sfrp1过表达降低了细胞上清液中I、III型胶原蛋白产量,分别为2123.65±543.73 vs.1127.92±194.73pg/ml、10.535±1.206 vs.5.524±1.236ng/ml(P均<0.05);Western blot检测发现Sfrp1过表达,与TGF-β1组相比,明显下调了α-SMA蛋白水平表达(P<0.05)。然而当Wnt/β-catenin信号通路的特异性激活剂Licl同时作用时,Sfrp1上述抗纤维化的作用均被抑制。第三部分:所选的Wnt/β-catenin信号通路相关基因多态性位点单个位点分析表明,SFRP1 rs7832767 C>T、CTNNB1 rs2293303C>T及WISP1 rs16893344C>T多态性位点在病例组及对照组中存在着显著的统计学差异(P值分别为0.002,0.009,0.007)。多因素Logistic回归分析显示,在SFRP1基因中,与携带rs7832767 CC基因型的个体相比,rs7832767 CT基因型携带者无患病风险(P=0.167),rs7832767 TT基因型携带者患病风险增加了3.13倍(校正OR=3.13,95%CI=1.78-5.51),rs7832767CT/TT基因型携带者患病风险增加了1.53倍(校正OR=1.53,95%CI=1.12-2.08);在CTNNB1基因中,与携带rs2293303 CC基因型的个体相比,rs2293303 CT基因型携带者患病风险增加了3.48倍(校正OR=3.48,95%CI=2.28-5.33),rs2293303 TT基因型携带者患病风险增加了7.37倍(校正OR=7.37,95%CI=2.08-26.16),rs2293303 CT/TT基因型携带者患病风险增加了3.72倍(校正OR=3.72,95%CI=2.46-5.62);在WISP1基因中,与携带rs16893344 CC基因型的个体相比,rs16893344 CT基因型携带者患病风险增加了2.43倍(校正OR=2.43,95%CI=1.70-3.47),rs16893344 TT基因型携带者患病风险增加了5.17倍(校正OR=5.17,95%CI=1.85-14.41),rs16893344 CT/TT基因型携带者患病风险增加了2.58倍(校正OR=2.58,95%CI=1.83-3.66)。在人口及临床特征的分层分析中,上述结果仍然显著,仅有少数例外。结论:(1)Wnt/β-catenin信号通路是参与并介导老龄急性心肌缺血损伤的关键靶点,急性心肌梗死后早期Wnt/β-catenin信号通路被持续激活,Sfrp1可以作为小分子基因治疗药物,具有抑制Wnt/β-catenin信号通路活性,改善心功能,减少心肌纤维化程度,抑制心肌细胞凋亡的效果和作用,从而有效保护老龄急性心肌缺血损伤;(2)细胞水平上证明Sfrp1抑制Wnt/β-catenin信号通路活性调节线粒体途径从而抑制心肌细胞凋亡。还证明Sfrp1抑制Wnt/β-catenin信号通路,通过有效的减少心肌成纤维细胞增殖,胶原合成,肌成纤维细胞表型转化,从而缓解心肌纤维化的进展;(3)Wnt/β-catenin信号通路SFRP1基因rs7832767 C>T、CTNNB1基因rs2293303C>T及WISP1基因rs16893344C>T位点的多态性改变可能与中国人群心肌梗死的遗传易感性相关,此结果有待于精心设计的更大规模不同种族人群的前瞻性研究来进行验证。