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冠心病稳定性心绞痛的治疗对患者的疾病的不良转归具有重大的意义,而血瘀是其基本病机之一。大量临床文献表明,应用活血化瘀药治疗冠心病稳定型心绞痛血瘀证具有良好的临床效果,但临床应用药物多为中药饮片、中成药或单一中药有效成分。中药饮片制剂存在作用成分、机制不清楚的缺点,中成药针对证型及症状较为单一,目前单一中药有效成分的新剂型虽有确切的临床效果,但不能充分发挥中药多成分、多途径、多靶点的优势。中医药现代化的发展要求中药方剂的研究要做到说清作用成分、作用靶点、作用环节。而组分配伍方剂作为时代背景下的先进产物,能够解决现临床中饮片质量不齐、作用成分、机制不清楚的确定,同时相比较于单一中药有效成分的新剂型更能发挥中药多成分、多途径、多靶点的优势。中药组分配伍方剂的运用,是中药研究的新途径,对中医提高疗效具有极大的临床价值。生物分子网络可以从基因转录、蛋白质互作用、生物代谢以及信号转导网络四个层面进行研究,是系统生物学研究的一种方法,可以解决现实中相互割裂的研究模式,可以对方剂进行系统、整体、尽量全面的分析。因此基于生物分子网络运用生物信息学的研究方法,可以实现在基因层面的共表达网络构建,从基因分子改变到信号通路的改变,全面认识药物作用机制。本研究拟通过严格的随机双盲对照的临床试验,验证活血化瘀组分配伍药物丹参通络胶囊的有效性及安全性,然后利用网络药理学预测丹参通络胶囊的作用靶点,并抽取部分患者的血液样本进行高通量测序,构建lncRNA-mRNA互作用网络,并进行GO及KEGG分析,挖掘药物作用机制。本研究将为组分配伍方剂的临床应用以及机制研究提供一定依据。1.文献综述:本部分对58篇临床文献以及30篇组分配伍相关文献进行研究,分别从活血化瘀药物治疗冠心病稳定性心绞痛的临床研究进展、组分配伍药物的研究及活血化瘀组分配伍药物的选择两个方面进行综述。2.临床研究目的:通过RCT临床试验,应用活血化瘀法组分配伍药物丹参通络胶囊及其模拟剂进行治疗,运用相应的疗效评价方法评价丹参通络胶囊的临床疗效,并对安全性指标进行观测。方法:冠心病稳定性心绞痛诊断参照“国际心脏病学会和协会”及“世界卫生组织临床命名标准化联合专题组报告《缺血性心脏病的命名及诊断标准》”制定,心绞痛分级诊断标准参照《全国中西医结合防治冠心病、心绞痛及心律失常研究座谈会修订(1979年9月,上海)》制定,心绞痛症状轻重分级标准参照1979年中西医结合治疗冠心病心绞痛及心律失常座谈会《冠心病心绞痛及心电图疗效评定标准》制定,冠心病稳定性心绞痛血瘀证诊断标准参照《中药新药治疗冠心病心绞痛的临床研究指导原则(2002年)》制定,中医症状分级参照本次研究标准。本次研究患者来源于广安门医院2017年3月至2017年12月的门诊患者,经筛选符合冠心病稳定性心绞痛血瘀证的患者共40例,随机进入治疗组或对照组。干预措施:两组均维持基础治疗西药,治疗组服用丹参通络胶囊(规格:0.4g/粒)进行治疗,用量为1粒/次,每日3次,口服;对照组服用模拟剂(规格:0.4g/粒)进行治疗,用量为1粒/次,每日3次,口服;两组导入期均为1周,疗程为4周。观察指标包括患者姓名、性别、年龄等一般资料。疗效指标包括:(1)心绞痛总有效率、心绞痛发作次数、持续时间以及心绞痛积分;(2)硝酸甘油用量、硝酸甘油停减率;(3)心电图疗效;(4)中医证候疗效及症状疗效。安全指标包括生命体征、血、尿、便常规以及肝功能、肾功能。试验结果应用SPSS19.0统计软件进行统计,用卡方检验进行检验。结果:首先对两组患者一般情况做基线比较,治疗组20例,其中男患者12例,女患者8例,年龄范围56-70,平均年龄62.15±4.66。对照组20例,其中男患者13例,女患者7例,年龄范围54-69,平均年龄61.2±4.57。两组基线比较,差异无统计学意义(p>0.05)。疗效方面:(1)心绞痛总有效率:治疗组总有效率为90%,对照组总有效率为60%;(2)心绞痛发作次数:两组治疗后治疗组疼痛次数明显少于对照组(p<0.05);(3)心绞痛积分:两组治疗前后心绞痛积分比较差异具有统计学意义(p<0.05);(4)硝酸甘油用量(mg):治疗前后两组间硝酸甘油用量比较差异具有统计学意义(p<0.05);(5)心电图疗效:治疗组总有效率80%,对照组心电图总有效率70%;(6)中医证候疗效:治疗组中医证候疗效总有效率90%,对照组中医证候疗效总有效率50%,两组间差异对比具有统计学意义(p<0.01),且治疗组在胸闷、胸痛、乏力的临床症状方面疗效较好;(7)两组前后两次的血常规、DIC、尿常规、便常规、肝肾功能等理化检查指标均在正常值范围内。3.实验研究:3.1网络药理学研究目的:运用网络药理学的方法,预测活血化瘀组分配伍药物丹参通络胶囊的可能作用靶点,并通过对靶点的GO及KEGG分析初步预测丹参通络胶囊的治疗靶点基因,可与下一步高通量测序结果进行共同分析。方法:搜索OMIM以及TTD数据库,搜索词为“稳定性心绞痛”“心绞痛”,可获得“冠心病稳定性心绞痛”相关疾病基因以及已知药物作用靶点,得到目标基因靶点集,命名为“CHD”;在TCMSP数据库中,将丹参通络胶囊的药物有效成分相应的化学物质,根据ADME相关特性一一进行确定并搜索,可获得相应化学物质分子模型文件,下载其相应的“.mo12”文件,并将所得“.mo12”文件应用PharmMapper数据库进行药物相似性分析,得到可能作用预测靶点集,命名为“Yao”;将两组靶点集的基因名称在Uniprot数据库中进行统一,具有多个命名的取第一个名称,将统一命名后的两组靶点集制作韦恩图,“CHD”及“Yao”的交集即为本次网络药理学实验预测丹参通络胶囊的作用靶点。将所得靶点应用GeneMANIA网络软件分析可以看出几个靶点基因见物理相关性及共表达特征。再运用MAS3.0进行分析,即可得到靶点基因功能、靶点作用通路及靶点间相互作用网络。结果:通过OMIM及TTD数据库搜索得到“CHD”靶点集,包含204个靶点基因;通过TCMSP、PharmMapper数据库预测得到“Yao”靶点集,包含286个八点基因。两个靶点集取交集后得到3个预测丹参通络胶囊的作用靶点,分别为IL10、F2、AR。GeneMANIA分析这3个八点基因发现3者显示出了 67.64%的物理相关性,但只有13.5%的共表达特征。应用MAS 3.0分析3个靶点基因功能,结果发现参与GO功能20个,参与KEGG通路12个。GO功能中排在前五位的为生理过程(G0:0065007)、细胞过程(G0:0009987)、生物调节(G0:0050789)、物理过程(G0:0007582)和结合(G0:0005488),占所有功能的50.8%。KEGG通路中主要参与了肌动蛋白细胞骨架调节、补体途径、表皮生长因子受体信号通路、细胞因子及其受体的相互作用等信号通路。3.2分子生物学实验目的:通过高通量测序技术,实际检测患者血液样本中转录组信息,构建lncRNA-mRNA共表达网络,从lncRNA对mRNA的靶向调控方面,全面的分析本次研究中已被注释以及未被注释的lncRNA,并通过分析有共表达关系的靶基因的GO功能及KEGG通路,挖掘丹参通络胶囊的作用机制。方法:血液样本的采集:通过血液白细胞提取方法提取患者血液中的白细胞并冻存。本次实验研究选取的血液样本为治疗组及对照组随机各抽取6个患者治疗前后的2个血液样本,共计24个血液样本。实验分组及目标基因组确定:实验首先分为A、B两大组,A组为治疗组,B组为对照组;每个大组又分为治疗前后两个小组,即A组分为A1(疗前组)、A2(疗后组),B组分为B1(疗前组)、B2(疗后组)。A、B两组差异基因组名分别为A1-A2以及B1-B2,两组差异基因取交集后,A1-A2组中需去除交集基因,所得基因组命名为A1-A2unique,为本次研究运用的差异基因组。差异基因筛选及确定:对24个血液样本进行质检,质检合格后进行高通量测序,利用hisat2、bowtie2、eXpress软件,运用FPKM算法,将测序结果与参考基因进行对比计算,从3方面进行表达水平检测,同时进行样品相关性检测。利用DESeq软件计算差异倍数,规定|log2FoldChange|>1且pvalue<0.05的差异基因为本次实验所要差异基因,lncRNA及mRNA均为此种筛选方法。共表达计算:将差异lncRNA及mRNA运用皮尔森相关系数进行计算,规定相关系数不低于0.8且p value<0.05的关系对为具有共表达关系。GO、KEGG富集分析:根据上一步具有共表达关系的差异基因,统计每个GO条目及KEGG通路中所包含差异基因个数,并运用超几何分布检验方法计算每个GO条目及KEGG通路中差异基因富集的显著性(Enrichment Score);GO功能使用topGO进行分析,并对BP、CC及MF三大功能为主的top10条目进行详细说明;KEGG则选取冠心病相关通路、炎症相关通路、以及富集基因较多的通路进行分析。结果:血液样本质量检测以及测序质量检测均达到相关标准,证明后续分析准确有效。差异基因筛选得到差异lncRNA共计181个,其中98个为上调基因,83个为下调基因;筛选得到差异mRNA共计312个,其中172个为上调基因,140个为下调基因。lncRNA及mRNA存在共表达关系有333对,其中226对为正相关108对为负相关。对其进行GO分析发现,基因功能主要集中在氧气运输以及维持氧稳态、细胞膜运输、与成肌细胞分化及丝状伪足形成以及免疫过程方面。对其信号通路方面进行分析发现,有显著基因差异改变的信号通路共有5个,其中cGMP-PKG信号通路(has 04022)以及toll样受体信号通路(has 04620)均是与冠心病密切相关通路,另外3个为与两通路同时相关的信号通路,MAPK信号通路(has 04010)、P13K-AKT信号通路(has 04151)以及细胞凋亡信号通路(has04210)。cGMP-PKG信号通路中存在CREB上调以及PDE3下调,toll样受体信号通路中存在p38下调,MAPK信号通路中存在DAXX、p38下调,P13K-AKT信号通路中存在CREB上调、Bim下调,细胞凋亡信号通路中存在DAXX、p38下调。4.结论:活血化瘀组分配伍药物丹参通络胶囊对冠心病稳定性心绞痛血瘀证患者具有良好的临床疗效,可有效的改善患者的临床症状,明显降低硝酸甘油用量及次数,安全性好,无不良反应;基于生物分子网络的分子生物学研究结果发现,共表达的差异基因主要集中在MAPK信号通路、cGMP-PKG信号通路以及toll样受体信号通路中,证明活血化瘀组分配伍药物丹参通络胶囊具有心脏保护功能,同时可以缓解炎症反应;其心脏保护功能可能通过DAXX/ASK1/p38以及cAMP/PKA/CREB信号过程实现;在cGMP-PKG信号通路、MAPK信号通路中存在的cAMP/PKA/CREB信号过程以及DAXX/ASK1/p38信号过程存在类似共同调节以及正反馈调节的改变,或可从侧面体现组分配伍药物的中医相须、相使的配伍思想;网络药理学的预测结果与分子生物学研究结果虽未完全吻合,但预测基因可通过间接作用抑制toll样受体信号通路,证明网络药理学预测药物作用靶基因具有一定的参考价值,体现在间接作用于相关信号通路。