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肺炎克雷伯菌作为一种重要的医院和社区获得性机会致病菌,通常会引发各种类型的感染,尤其是K1和K2血清型高毒力菌株给人类公共卫生事业和动物的健康养殖带来严重的威胁。由于抗生素的滥用,以产碳青霉烯酶和产超广谱β-内酰胺酶为代表的多重耐药肺炎克雷伯菌菌株不断出现,特别是近年来产碳青霉烯酶高毒力菌株的出现,给肺炎克雷伯菌感染的治疗带来了更为严峻的挑战。噬菌体疗法作为抗生素的替代或补充疗法,被视为多重耐药肺炎克雷伯菌感染的重要解决方案之一。然而,像很多其他细菌一样,肺炎克雷伯菌在被噬菌体裂解的过程中也会发生针对噬菌体的抗性突变,极大地限制了噬菌体治疗的应用。近年研究人员针对噬菌体对宿主细菌的识别以及细菌抵抗噬菌体侵染的机制已取得丰硕的研究成果,但关于肺炎克雷伯菌的相关研究却比较缺乏。本课题组之前的研究也发现,宿主细菌K.pneumoniae K7（K2血清型）在与噬菌体GH-K3互作的过程当中很容易产生噬菌体抗性突变菌株,但其发生的机理还尚不清楚。肺炎克雷伯菌的噬菌体抗性产生机制的揭示,对提高噬菌体对肺炎克雷伯菌感染的治疗效果具有重要的参考价值。因此,本研究旨在揭示噬菌体GH-K3诱导K.pneumoniae K7产生噬菌体抗性的机制。本研究首先对噬菌体GH-K3的宿主谱、一步生长曲线等生物学特性进行了研究,并对该噬菌体的全基因组进行测序和生物信息学分析。结果表明,噬菌体GH-K3隶属于长尾噬菌体家族,爆发量为291 PFU/细胞。该噬菌体的基因组长度为49427 bp,总共含有77个开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）,与13种噬菌体具有高度的核苷酸序列相似性和紧密的进化关系。上述数据比较全面地揭示了噬菌体GH-K3的生物学特性,为后续该噬菌体诱导宿主细菌产生噬菌体抗性的研究奠定了良好的基础。后续本研究对肺炎克雷伯菌的噬菌体抗性产生机制展开探索。研究表明,K.pneumoniae K7在GH-K3的压力下所衍生的噬菌体抗性突变菌株几乎都拥有粗糙的菌落形态。通过菌液离心试验、扫描电子显微镜观察以及噬菌体吸附试验证实以K.pneumoniae K7RR为代表的菌落形态“粗糙型”突变菌株的多糖吸附受体发生缺失突变,这与过去的文献报道一致。另外,本研究还意外发现极少数突变菌株具有“大而光滑”的菌落形态,将其命名为K.pneumoniae K7RB。K7RB的噬菌体抗性与表面多糖无关,但可能与蛋白吸附受体的缺失有关,对于肺炎克雷伯菌来说,这是一种新型的噬菌体抗性产生方式。虽然肺炎克雷伯菌表面多糖对于GH-K3的募集具有主导作用,但是细菌表面蛋白受体可能才是该噬菌体侵染宿主的决定性因素。上述数据所揭示的肺炎克雷伯菌抵抗噬菌体侵染的过程仅限于噬菌体吸附阶段,进一步说明了该细菌拥有“多糖-蛋白”两级受体吸附模式的可能性。为了阐明肺炎克雷伯菌对GH-K3的噬菌体抗性的产生机制,本研究针对K.pneumoniae K7RR和K7RB分别展开试验。阿尔新蓝染色的结果证实,K7RR的荚膜多糖（Capsular Polysaccharide,CPS）合成存在严重障碍。另外,银染的结果则表明该突变菌株的脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）组分未发生明显变化,从而确定GH-K3的初级吸附受体成分为CPS而不是LPS。与K7相比,K7RR在全基因组水平上并未发生基因突变。液相色谱-串联质谱（Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry,LC-MS-MS）分析表明,该突变菌株中三种由荚膜多糖合成相关基因簇（Capsular Polysaccharide Synthesis,cps）编码的葡糖基转移酶（Glucosyltransferases）——GT-1、GT-2和WcaJ的丰度剧烈下调。进一步研究发现,单独缺失GT-1、GT-2和wcaJ任意一个基因均导致细菌CPS合成障碍并伴随着GH-K3敏感性的丧失,表明这三种葡糖基转移酶均参与了维持细菌对噬菌体敏感性的过程。然而,拥有高分子量CPS残基（>250 kDa）的K7（ΔGT-1）和K7（ΔwcaJ）仍然可以被一部分GH-K3吸附,表明GT-1或wcaJ的缺失可能使CPS残基保留了一定的噬菌体结合位点。因此,上述数据表明K7RR的噬菌体抗性突变及其粗糙的菌落形态与三个葡糖基转移酶——GT-1、GT-2和WcaJ表达抑制所导致的CPS合成障碍有关。为了揭示K.pneumoniae K7RB的噬菌体抗性产生机制,本研究分析了该突变菌株与K7之间的序列差异基因和差异表达蛋白。事实上,K7RB中ompC基因的第711位碱基“T”和第712位碱基“A”之间比野生型菌株少一个“G”,这是该突变菌株唯一的基因突变位点。LC-MS-MS分析则表明,在K7与K7RB之间的差异表达蛋白中,K7RB中的四个外膜蛋白——OmpC、OmpN、KPN02430和OmpF存在极为明显的表达抑制现象。基因回补试验表明,只有过表达ompC的K7RB可被GH-K3所裂解。相比之下,K7中ompC的第712位碱基缺失可引发OmpC表达抑制,从而导致该菌株对GH-K3的侵染产生抗性。这些试验均可证明OmpC是GH-K3的关键受体,而K7RB的噬菌体抗性为自身ompC基因突变所致。另外,三株K2血清型肺炎克雷伯菌——K.pneumoniae KPP14、KPP27和KPP36具有与K7接近的OmpC表达水平。除了第255、342、344和348个氨基酸位点以外,四个菌株的OmpC序列完全一致。但是,GH-K3对KPP27的成斑率很低,而KPP14和KPP36完全不能被该噬菌体所侵染。然而,当这三个菌株自身的ompC基因被来自K7的ompC基因替换之后,它们对GH-K3的敏感性均显著提高,表明来源于K7的OmpC是GH-K3最合适的二级吸附受体。综上所述,本研究不仅阐释了两种噬菌体抗性菌株——K.pneumoniae K7RR和K7RB的产生机理而且证实了GH-K3对宿主菌的吸附存在“CPS-OmpC”的两级受体模式。因此,本研究丰富了肺炎克雷伯菌噬菌体受体的认知,对于后续其他细菌的噬菌体抗性产生机制研究具有借鉴意义。