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戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus，HEV）是一种无包膜的单链正义RNA病毒，具有四种基因型，其宿主范围极为广泛，由该病毒引起的戊型肝炎(HepatitisE，HE)是一种人畜共患疾病。戊型肝炎主要流行于发展中国家，但是近年来随着检测试剂灵敏度的提高发现戊肝在一些发达国家和地区也呈现较高的流行水平。WHO一项最新的统计表明，世界上每年约有1400万临床戊肝感染病例，死亡人数约30万，其中5200例为胎儿时期死亡。孕妇、老年人等免疫力低下人群和已有基础性肝病的患者更易感染戊肝，而孕妇感染后症状尤甚，死亡率可高达20％。 戊型肝炎病毒的类病毒颗粒p239具有良好的免疫原性，目前基于p239类病毒颗粒开发的戊型肝炎预防性疫苗Hecolin(@)已在中国成功上市。戊肝病毒衣壳蛋白的二聚体突出是免疫优势表位的主要集中区域。本实验室在前期研究中通过杂交瘤技术筛选获得了较为完善的戊肝单抗盘，其中发现戊型肝炎病毒的两株中和单抗8C11、8H3在中和病毒时存在罕见的单向正协同作用，即8C11可以增强8H3对病毒的中和能力，该现象的分子机制尚待探究。本研究针对戊型肝炎病毒抗体盘中与8C11抗体具有协同作用的单克隆抗体，利用抗体间的协同作用制备抗原-双抗体免疫复合物，以X射线衍射晶体学为手段，解析免疫复合物的空间结构，对抗体所识别的中和表位进行定位的同时获得抗体间协同作用的结构基础，并辅以另外的生物化学与分子生物学方法辅助阐明抗体间协同作用的分子机制，同时精确定位中和表位。 首先，通过酶联免疫吸附实验考察了抗体8C11对8H3与HEV抗原二聚体的结合能力的影响，发现在HEV-E2二聚体中，抗体8C11存在时，8H3与抗原E2的结合能力提升了10倍;反之，8H3的存在对8C11与抗原的结合无增强效果，这说明抗体8C11对8H3的正向协同增强作用具有单向性;利用病毒捕获实验同样验证了抗体8C11能够单向增强8H3的病毒中和作用，但随着8C11浓度的升高，增强效果呈现先上升后下降的趋势。 其次，成功制备了可用于结晶的8H3Fab、8C11Fab和E2二聚体抗原，培养出高质量的8H3Fab晶体，晶体衍射的分辨率为1.98(A)。进而通过抗原抗体复合物制备条件的摸索，成功制备了可用于晶体培养的抗原-双抗体复合物E2s-8C11Fab-8H3Fab，最终培养获得可用于衍射的复合物晶体，晶体的最终衍射分辨率达到3.5(A)。对结晶样品的监测显示，结晶过程中复合物中的E2会降解为E2s，同实验室之前的研究结果一致，这将有利于蛋白晶体的形成。通过分子置换的方法解析双抗体复合物的空间结构，结构分析表明复合物中一个E2s二聚体结合两个8C11Fab和两个8H3Fab;此外，8H3Fab与抗原E2之间主要通过氢键、静电作用、疏水作用和分子间作用力相结合，8H3Fab与8C11Fab之间主要通过氢键和分子间作用力发生相互作用。通过分析8H3Fab与E2s的相互作用界面，选择了13个氨基酸位点进行8H3所识别表位的关键位点验证，这13个点分别为I529、E531、E549、T552、T553、K554、T563、T564、S566、Q568、T586、R542、N560;分析两个Fab分子之间的相互作用界面，得知其可能的相互作用位点为8C11重链上的Lys66、Ser88、Arg68、Asp88;8H3轻链上的Lys18、Asn82、Asp66。另外，在复合物中，8H3的作用使得8C11Fab在空间位置发生6.5°的旋转。 第三，本论文研究应用丙氨酸扫描法在基因I型E2上构建了8H3潜在结合位点的单点突变克隆。综合Western blotting、ELISA、AUC的实验结果，得出抗体8H3所识别表位的关键氨基酸位点为E549、k554。应用酶联免疫吸附法证实，13个潜在的8H3识别表位的位点对8C11与8H3抗体之间的单向协同作用无明显影响。 最后，对复合物中8C11与8H3的相互作用进行了考察。摸索了重组抗体8C11的表达。构建了一系列克隆，在293系列细胞系-VRC8400载体表达系统、HepG2细胞-PTT22载体表达系统、以及BEVS系统中对鼠源抗体8C11的表达进行了摸索与尝试。成功利用CHO系统表达了8C11人鼠嵌合抗体，利用丙氨酸扫描的方式对8C11重链上与8H3相互作用的可能的氨基酸位点Lys8C11-H66，Ser8C11-H67，Asp8C11-H88，Arg8C11-H68进行单点突变和Lys8C11-H66，Ser8C11-H67，Asp8C11-H88三点联合突变，验证了突变抗体的活性，发现R68位点为影响8C11抗体活性的关键氨基酸位点;考察了单点及三点联合突变的8C11抗体对8H3的协同作用，得到8C11上影响抗体8C11与8H3相互作用的关键位点为Lys8C11-H66，Ser8C11-H67，Asp8C11-H88，即8C11通过上述三个氨基酸位点与8H3发生相互作用。这就从分子水平上初步验证了8C11Fab与8H3Fab分子之间的相互作用是导致抗体间协同增强作用的原因。 综上所述，本研究利用结构生物学，生物化学与分子生物学等方法对戊肝单抗盘中抗体8H3与8C11之间的单向协同增强作用机制进行了研究，获得了世界上首个双抗体HEV免疫复合物的结构，在生物大分子结构研究及病毒学和免疫学的研究中具有明显的创新性，为抗体间相互作用的研究提供了结构基础;精确定位了8H3中和表位，完善了戊肝疫苗的质量分析体系;获得了抗体8C11与8H3相互作用的关键位点，初步从分子水平上阐释了抗体之间正协同作用的机制，为病毒中和抗体的研究提供了新的思路。