论文部分内容阅读
哺乳动物呼肠孤病毒(Mammalian reovirus，MRV)是双链RNA病毒，可通过气溶胶或粪-口途径感染脊椎动物，亲嗜肠上皮、胆管上皮、肺上皮、白细胞、中枢神经系统内皮。已知MRV的分离宿主物种有:人，鸟，牛，猴，羊，猪，狒狒和蝙蝠等。虽然MRV是低致病性病毒，多数情况下被感染宿主仅表现轻微症状，但由于该病毒容易与其他亚型发生重组的特点，可能造成病毒的毒力增强，导致单一宿主或动物种群爆发呼吸道疾病、胃肠炎、胆道闭锁、脑水肿或脑脊髓炎等疾病。树鼩与人类及灵长类动物较高的遗传同源性，使研究者看到了它在病毒感染和临床前药物开发研究中的独特价值。但在树鼩饲养繁育过程中，会遇到细菌或病毒等病原体感染导致的健康威胁，严重时会引起动物死亡。本研究从树鼩偶发腹泻事件推测可能是由某种病毒感染引起，首次从树鼩(Tree Shrew)这一物种分离到两株树鼩呼肠孤病毒(Mammalian reovirus/Tree Shrew, MRV/TS)。MRV/TS对树鼩种群健康是否存在潜在威胁，是否影响树鼩种群质量进而影响其它类型病毒感染、药理毒理的研究。基于这些问题，本课题通过MRV/TS的分离鉴定与全基因测序及其在细胞水平和活体水平的感染特性和感染机制等系列研究取得了以下几方面结果:
1.MRV1/TS/2011和MRV3/TS/2012的分离鉴定和全基因组测序解析
MRV/TS经Vero细胞培养分离获得。病毒RNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳和浓缩病毒的负染电镜将未知病原初步判定为两株不同的呼肠孤病毒，命名为MRV1/TS/2011和MRV3/TS/2012。分别用一代Sanger测序和二代高通量测序获取了两株病毒的10条基因序列全长。基因结构特征分析显示，MRV/TS具有MRV特有的5和3末端保守序列。构建系统发育进化树发现，新分离MRV/TS与人、蝙蝠、猪分离株遗传关系较近。MRV1/TS/2011位于Ⅰ型(MRV1)分支、MRV3/TS/2012位于Ⅲ型(MRV3)分支，MRV/TS是多种物种来源毒株的重组株。明确了树鼩源呼肠孤病毒株的病毒分型和进化关系。
2.MRV1/TS/2011和MRV3/TS/2012在体外细胞水平的感染特性研究
完成了树鼩原代肠上皮细胞tIECs、树鼩原代肺细胞tAECs、树鼩原代神经元细胞tNCs的体外培养及标记分子的IF鉴定。细胞电镜超薄切片显示病毒复制发生在细胞质，形成晶格状排列的包涵体。MRV厂TS的蚀斑小而无法数清。IF可见MRV/TS在tIECs、tAECs、tNCs中的复制。抗体的交叉中和试验IF结果显示两株病毒的抗原无交叉性。绘制分析MRV/TS感染tIECs、tAECs、tNCs、KMB17、Vero共5种细胞中上清和胞内的病毒载量-时间曲线发现，MRV1/TS/2011较MRV3/TS/2012的感染力强;tAECs较tIECs更易感MRV/TS;MRV/TS对KMB17和Vero入胞能力有限，入胞后在Vero细胞中增殖力强于KMB17，在KMB17中出胞困难，上清中病毒载量远低于胞内;MRV/TS在tNCs入胞和出胞都较容易，但复制增殖力有限。
对JAM-A和NgR1受体与MRV/TS感染的关系进行了研究。首先，利用SMARTerRACEPCR调取树鼩JAM-A、NgR1受体基因，RT-qPCR测定JAM-A、NgR1在树鼩各组织表达量分布，JAM-A主要表达在外周各组织，其中肠道较其它组织高;NgR1主要表达在中枢神经组织，其中大脑颞叶NgR1表达量最高。其次，测定了MRV/TS感染tIECs、tAECs后JAM-AmRNA表达量变化，在0～1.5h病毒吸附期，JAM-A的表达量随时间或浓度较内参基因GAPDH无明显上调或下调变化规律;而在0～72h病毒复制增殖期，JAM-A的表达量随时间呈上调变化。再次，利用抗细胞受体法证实人单抗hJAM-a10.4和兔多抗JAM-Aab180821与NA共同作用可阻断MRV1/TS/2011和MRV3/TS/2012对tAECS、tIECs的感染。最后，利用抗细胞受体法和拮抗剂处理证实羊多抗NgR1抗体、NEP1-40、PI-PLC与NA共同作用可阻断MRV1/TS/2011和MRV3/TS/2012对tNCs的感染。
本研究证实了MRV/TS对树鼩细胞的易感性，提供了MRV/TS对不同种属来源细胞的感染特性数据，且发现Ⅰ型和Ⅲ型呼肠孤病毒均可感染神经元细胞，这与以往的Ⅰ型呼肠孤病毒不感染神经元细胞的结论不同。并在树鼩细胞上验证了JAM-A受体和NgR1受体介导MRV病毒吸附蛋白VAP与宿主细胞的结合作用。体外细胞水平感染特性研究为活体水平感染特性研究奠定了基础。
3.MRV1/TS/2011和MRV3/TS/2012在活体水平的感染特性
两株病毒经口服灌胃感染离乳树鼩，二者在组织亲嗜性和动物感染特性呈现差异。MRV1/TS/2011在感染后第14d血液、粪便、主要组织脏器中都检测到复制拷贝数约103copies/μL的病毒载量，之后被清除;MRV3/TS/2012感染后血液、粪便中一直检测到微量的病毒，仅肺组织在第1d、8d、14d检测到103copies/μL，之后被清除。病毒σ1IHC抗原定位显示MRV1/TS/2011在肝脏的复制，MRV3/TS/2012在肺脏的复制。本研究测定了两株病毒感染tIECs转录组表达谱，MRV1/TS/2011与MRV3/TS/2012生物学特征接近的宿主基因簇表达有显著性差异。回顾总结分析MRV/TS对新生乳树鼩具有强感染力，可造成严重的间充质肺炎和脑炎，而MRV/TS可感染离乳树鼩但不造成死亡和严重临床病理后果。活体水平感染特性研究揭示了MRV/TS对树鼩的感染具有型别差异性和年龄依赖性。
综上所述，本研究新分离两株MRV/TS来自新的宿主—树鼩，且是MRV的重组株，为MRV的进化基因库增加了新宿主和新参考。与以往的研究不同，本研究选择在体外培养的树鼩原代细胞上进行病毒感染实验，更接近于实际感染的情况，为呼肠孤病毒研究材料的选择提供基础数据。树鼩JAM-A和NgR1介导MRV/TS感染的研究丰富了外周病毒受体和神经病毒受体研究的内容。MRV/TS的病原学特征及其对分离宿主树鼩的感染特性，为深入了解MRV病毒的进化历程、对哺乳动物的组织损伤机制，提供基础理论依据。MRV3/TS/2012对JAM-A的依赖性较MRV1/TS/2011低，MRV1/TS/2011较MRV3/TS/2012对树鼩感染力强，提示两株病毒关键氨基酸位点的差异，需进一步进行验证分析。
1.MRV1/TS/2011和MRV3/TS/2012的分离鉴定和全基因组测序解析
MRV/TS经Vero细胞培养分离获得。病毒RNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳和浓缩病毒的负染电镜将未知病原初步判定为两株不同的呼肠孤病毒，命名为MRV1/TS/2011和MRV3/TS/2012。分别用一代Sanger测序和二代高通量测序获取了两株病毒的10条基因序列全长。基因结构特征分析显示，MRV/TS具有MRV特有的5和3末端保守序列。构建系统发育进化树发现，新分离MRV/TS与人、蝙蝠、猪分离株遗传关系较近。MRV1/TS/2011位于Ⅰ型(MRV1)分支、MRV3/TS/2012位于Ⅲ型(MRV3)分支，MRV/TS是多种物种来源毒株的重组株。明确了树鼩源呼肠孤病毒株的病毒分型和进化关系。
2.MRV1/TS/2011和MRV3/TS/2012在体外细胞水平的感染特性研究
完成了树鼩原代肠上皮细胞tIECs、树鼩原代肺细胞tAECs、树鼩原代神经元细胞tNCs的体外培养及标记分子的IF鉴定。细胞电镜超薄切片显示病毒复制发生在细胞质，形成晶格状排列的包涵体。MRV厂TS的蚀斑小而无法数清。IF可见MRV/TS在tIECs、tAECs、tNCs中的复制。抗体的交叉中和试验IF结果显示两株病毒的抗原无交叉性。绘制分析MRV/TS感染tIECs、tAECs、tNCs、KMB17、Vero共5种细胞中上清和胞内的病毒载量-时间曲线发现，MRV1/TS/2011较MRV3/TS/2012的感染力强;tAECs较tIECs更易感MRV/TS;MRV/TS对KMB17和Vero入胞能力有限，入胞后在Vero细胞中增殖力强于KMB17，在KMB17中出胞困难，上清中病毒载量远低于胞内;MRV/TS在tNCs入胞和出胞都较容易，但复制增殖力有限。
对JAM-A和NgR1受体与MRV/TS感染的关系进行了研究。首先，利用SMARTerRACEPCR调取树鼩JAM-A、NgR1受体基因，RT-qPCR测定JAM-A、NgR1在树鼩各组织表达量分布，JAM-A主要表达在外周各组织，其中肠道较其它组织高;NgR1主要表达在中枢神经组织，其中大脑颞叶NgR1表达量最高。其次，测定了MRV/TS感染tIECs、tAECs后JAM-AmRNA表达量变化，在0～1.5h病毒吸附期，JAM-A的表达量随时间或浓度较内参基因GAPDH无明显上调或下调变化规律;而在0～72h病毒复制增殖期，JAM-A的表达量随时间呈上调变化。再次，利用抗细胞受体法证实人单抗hJAM-a10.4和兔多抗JAM-Aab180821与NA共同作用可阻断MRV1/TS/2011和MRV3/TS/2012对tAECS、tIECs的感染。最后，利用抗细胞受体法和拮抗剂处理证实羊多抗NgR1抗体、NEP1-40、PI-PLC与NA共同作用可阻断MRV1/TS/2011和MRV3/TS/2012对tNCs的感染。
本研究证实了MRV/TS对树鼩细胞的易感性，提供了MRV/TS对不同种属来源细胞的感染特性数据，且发现Ⅰ型和Ⅲ型呼肠孤病毒均可感染神经元细胞，这与以往的Ⅰ型呼肠孤病毒不感染神经元细胞的结论不同。并在树鼩细胞上验证了JAM-A受体和NgR1受体介导MRV病毒吸附蛋白VAP与宿主细胞的结合作用。体外细胞水平感染特性研究为活体水平感染特性研究奠定了基础。
3.MRV1/TS/2011和MRV3/TS/2012在活体水平的感染特性
两株病毒经口服灌胃感染离乳树鼩，二者在组织亲嗜性和动物感染特性呈现差异。MRV1/TS/2011在感染后第14d血液、粪便、主要组织脏器中都检测到复制拷贝数约103copies/μL的病毒载量，之后被清除;MRV3/TS/2012感染后血液、粪便中一直检测到微量的病毒，仅肺组织在第1d、8d、14d检测到103copies/μL，之后被清除。病毒σ1IHC抗原定位显示MRV1/TS/2011在肝脏的复制，MRV3/TS/2012在肺脏的复制。本研究测定了两株病毒感染tIECs转录组表达谱，MRV1/TS/2011与MRV3/TS/2012生物学特征接近的宿主基因簇表达有显著性差异。回顾总结分析MRV/TS对新生乳树鼩具有强感染力，可造成严重的间充质肺炎和脑炎，而MRV/TS可感染离乳树鼩但不造成死亡和严重临床病理后果。活体水平感染特性研究揭示了MRV/TS对树鼩的感染具有型别差异性和年龄依赖性。
综上所述，本研究新分离两株MRV/TS来自新的宿主—树鼩，且是MRV的重组株，为MRV的进化基因库增加了新宿主和新参考。与以往的研究不同，本研究选择在体外培养的树鼩原代细胞上进行病毒感染实验，更接近于实际感染的情况，为呼肠孤病毒研究材料的选择提供基础数据。树鼩JAM-A和NgR1介导MRV/TS感染的研究丰富了外周病毒受体和神经病毒受体研究的内容。MRV/TS的病原学特征及其对分离宿主树鼩的感染特性，为深入了解MRV病毒的进化历程、对哺乳动物的组织损伤机制，提供基础理论依据。MRV3/TS/2012对JAM-A的依赖性较MRV1/TS/2011低，MRV1/TS/2011较MRV3/TS/2012对树鼩感染力强，提示两株病毒关键氨基酸位点的差异，需进一步进行验证分析。