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研究背景:梅毒是由梅毒螺旋体(Tp)感染所致的一种严重危害人类身心健康的性传播疾病,但迄今为止尚未研发出梅毒疫苗,早期诊断梅毒成为防控梅毒的重要措施。梅毒呈多阶段性发展,临床表现复杂多样,常需借助梅毒实验室检测明确诊断,主要为血清学方法。近十余年来,基于重组Tp诊断抗原的血清学方法大力促进了梅毒特异性实验室诊断的快速发展,但目前所采用的重组抗原对诊断早/晚期梅毒,或区分不同感染阶段,或疗效判断仍然存在不足。前期研究表明,Tp鞭毛钩状基复合蛋白Tp0727和周质锌结合蛋白Tp0163对Tp感染兔和梅毒患者血清有较强免疫反应性,显示出潜在诊断价值。目的:评价基于Tp0727和Tp0163重组蛋白的ELISA方法对临床样本的诊断作用,为筛选新型梅毒诊断抗原提供实验依据。方法:1.在Genbank上查询Tp0727和Tp0163全基因序列,设计特异性引物,PCR扩增两基因片段;构建pET28a-Tp0727和pET28a-Tp0163重组载体;载体经测序鉴定后转化到E.coli BL21(DE3)表达载体中。2.IPTG诱导表达Tp0727和Tp0163重组蛋白;Ni2+-NTA亲和层析纯化重组蛋白;Western Blot检测重组纯化蛋白与Tp感染兔血清的免疫反应性和特异性。3.建立重组蛋白Tp0727和Tp0163间接ELISA方法,检测各期梅毒血清(209例)、交叉血清(93例)和体检阴性血清(96例),检测结果与TPPA、TRUST法比较分析,评价Tp0727-ELISA和Tp0163-ELISA的诊断价值。结果:1.PCR扩增得到约1392bp和861bp大小基因片段,与Tp0727和Tp0163基因大小相符;重组质粒经测序鉴定,证实插入基因为目的基因。2.重组质粒表达目的蛋白分别为49kDa(Tp0727)和35kDa(Tp0163),WB显示两者均与Tp感染兔血清有特异性免疫反应。3.ROC曲线分析结果表明,以TPPA检测结果为金标准,Tp0727-ELISA和Tp0163-ELISA的ROC曲线下面积分别为0.9930和0.9751,表明两种方法诊断效果较好。4.Tp0727-ELISA和Tp0163-ELISA检测临床样本特异性Tp-IgG结果与TPPA符合率较高,分别为95.0%和91.7%;敏感性分别为91.9%和88.0%,特异性分别为98.4%和95.8%。Tp0727-ELISA和Tp0163-ELISA法OD值变化与TRUST滴度水平变化的相关系数分别为0.705和0.735(P<0.05),说明两种ELISA与TRUST方法存在一定相关性。结论:Tp0727和Tp0163具有潜在的梅毒血清学诊断价值,可望成为梅毒候选诊断抗原。