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本论文主要从细菌厌氧呼吸链电子传递组分的角度,结合微生物生理学、生物化学与分子生物学的研究方法对脱色希瓦氏菌S12(Shewanella decolorationisS12)偶氮呼吸与Fe(Ⅲ)呼吸的相互关系及电子传递机理进行研究。通过相关的一系列生理、生化与分子实验,发现了Fe(Ⅲ)除作为菌株S12偶氮呼吸的电子竞争者抑制偶氮呼吸以外还可以作为电子传递媒介发挥促进作用,而这两种作用与Fe(Ⅲ)的形态及浓度直接相关,本质上是因为这两种呼吸过程在相同电子供体条件下使用不完全相同但却有规律的电子传递链组分。在此基础上,还研究了两种呼吸过程分别在不同电子供体条件下的两套不同的电子传递途径,并特别研究了还原酶在两种呼吸中的作用。本论文主要取得了以下结论和认识,
(1)Fe(Ⅲ)对偶氮呼吸的影响与其形态及浓度直接相关。不同形态和浓度的Fe(Ⅲ)在脱色希瓦氏菌S12的偶氮呼吸中作为电子竞争者或电子传递媒介发挥不同的作用。不可溶性Fe(Ⅲ)和高浓度可溶性Fe(Ⅲ)作为电子竞争者会抑制偶氮呼吸,Fe(Ⅲ)与偶氮染料竞争电子资源,二者很可能使用同一种外膜末端还原酶。脱色希瓦氏菌S12细胞存在Fe(Ⅱ)→ Fe(Ⅲ)氧化还原循环,低浓度可溶性Fe(Ⅲ)可以作为替代醌循环的电子传递媒介对偶氮呼吸发挥一定的促进作用。
(2)电子传递抑制剂实验表明,脱色希瓦氏菌S12的偶氮呼吸和Fe(Ⅲ)呼吸是与电子传递紧密相关的过程,使用的电子传递链组分不完全相同,反映整细胞的厌氧呼吸电子传递链呈分支节点的网络状,两种呼吸过程至少存在两套不同的电子传递途径。当以甲酸钠、乳酸钠或氢气为电子供体时,Fe(Ⅲ)呼吸可以不像偶氮呼吸那样需要依赖甲基萘醌传递电子,这也为(1)中“可溶性Fe(Ⅲ)可以作为替代醌循环的电子传递媒介对偶氮呼吸发挥促进作用”提供证据。当以NADH为电子供体时,偶氮染料可以从NADH脱氢酶直接获取电子实现还原,而Fe(Ⅲ)则必须经过细胞色素类蛋白的媒介作用获取电子。
(3)利用menB基因定向突变方法获得了1株菌株S12的甲基萘醌合成缺陷型,通过对该菌株研究发现甲基萘醌在脱色希瓦氏菌S12利用不同电子供体进行偶氮呼吸和Fe(Ⅲ)呼吸中发挥不相同的作用。在以甲酸钠为电子供体时,甲基萘醌是偶氮呼吸不可或缺的电子传递组分。而甲基萘醌对Fe(Ⅲ)呼吸则不是唯一和必须的,因为Fe(Ⅲ)呼吸还可利用甲基萘醌以外的电子传递组分,这也是上述(1)中可溶性Fe(Ⅲ)可以替代醌循环对偶氮呼吸发挥促进作用的因为。当以NADH为电子供体时,两种呼吸都不需要甲基萘醌传递电子。这印证了上述(2)的结论。
(4)通过基因组DNA随机突变文库的构建与筛选获得了1株不能合成成熟细胞色素c的ccmA基因突变株,通过对该菌株研究发现成熟细胞色素c在不同的电子供体条件下的脱色希瓦氏菌S12偶氮呼吸和Fe(Ⅲ)呼吸中发挥不相同的作用。在以甲酸钠为电子供体时偶氮呼吸需要成熟细胞色素c来传递电子而当以NADH为电子供体时则不需要。对于Fe(Ⅲ)呼吸不论以甲酸钠或NADH为电子供体时都需要成熟细胞色素c传递来电子。这又印证了上述(2)的结论。
(5)脱色希瓦氏菌S12细胞体内存在非特异性的偶氮还原酶,这是一种FMN依赖型的NADH-偶氮还原酶(NADH-AzoR)。通过把菌株S12的非特异性偶氮还原酶基因克隆到大肠杆菌中进行表达研究,发现NADH-偶氮还原酶需要以NADH为电子供体,通过FMN结合位点的活性中心把电子传递给偶氮染料,实现染料的还原降解,却不能直接催化Fe(Ⅲ)的还原。这与上述(2)(3)(4)结果相符。
对脱色希瓦氏菌S12偶氮呼吸和Fe(Ⅲ)呼吸关系的研究,加深了细菌厌氧呼吸机理的认识,具有重要的理论和实践意义:(1)在实验室前期研究提出了偶氮还原的呼吸本质以后,本论文进一步明确了细菌偶氮呼吸的电子传递机制,揭示了细菌偶氮呼吸和Fe(Ⅲ)呼吸电子传递途径的异同及相互关系,丰富了细菌厌氧呼吸理论,促进了细菌生理学基础理论的研究。(2)本论文研究发现Fe(Ⅲ)既是电子竞争者,但在一定条件下它也能发挥电子传递媒介的作用促进偶氮呼吸。通过对铁的形态及浓度的适当选择与控制可以获得更高的偶氮还原效率,可为合理有效地利用Fe(Ⅲ)治理偶氮化合物引起的环境污染问题、提高生物修复效率提供科学理论指导。