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人Pgn是分子量为92kD的糖蛋白,由一个丝氨酸蛋白酶结构域和5个通过二硫键连接的饼环区(Kringle)构成,每个饼环区由80个氨基酸组成,分子量约为14kD,含3个二硫键,形成双环状构象。Kringle5是Pgn的第五个饼环区结构,研究证实Kringle5在体外具有抑制内皮细胞增殖、抑制内皮细胞迁移的生物学活性,在体内可抑制多种血管新生模型的新生血管形成(angiogenesis),进而可抑制肿瘤的生长和转移,在实体瘤、糖尿病视网膜病变、风湿性关节炎等疾病的治疗中有广泛的应用前景。
Kringle5含有由3个二硫键形成的Kringle结构和Kringle结构外侧的2个臂,本研究构建的Kringle5蛋白去除了这2个臂而保留了3个二硫键的完整结构。本研究在我室前期对Kringle5实验室规模研究(见第一章)的基础上,对Kringle5的生产制备工艺(见第二章和第三章)进行了研究,建立了Kringle5的制备工艺；本研究进一步对Kringle5的生物学活性进行了深入研究,包括对Kringle5体外抑制血管内皮细胞增殖的效果和机制(见第四章第一节)进行了研究、对Kringle5体外抑制血管内皮细胞迁移和血管形成的效果(见第四章第二节)进行了研究、对Kringle5抑制小鼠移植瘤的效果和机制(见第四章第三节)进行了研究,这些工作为Kringle5蛋白的生物制剂的开发奠定了重要基础；同时,本研究还采用急性经口毒性试验(见第五章第一节)、遗传毒性试验(见第五章第二节)和大鼠30d喂养试验(见第五章第三节)对Kringle5的毒理学进行了系统研究。本研究是新型抗肿瘤制剂-Kringle5蛋白的新药申报材料的核心组成部分,为Kringle5蛋白的新药开发奠定了基础。
1基因重组Kringle5蛋白的原核表达体系的建立
本研究以纤溶酶原cDNA为模板,PCR扩增了Kringle5基因,经过适当酶切后构建表达载体pBV220/Kringle5,转入大肠杆菌JM109进行温控诱导表达,表达产物经纯化、复性后检测其抑制鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管新生的生物学活性。实验结果证实带有重组质粒pBV220/Kringle5的大肠杆菌经温控诱导后可表达目的蛋白,其表达量占菌体总蛋白总量的34.8％,免疫学鉴定结果表明该异源重组蛋白具有His-tag抗原活性,CAM实验证实具有抑制血管新生的野生活性。
JM109/pBV220/Kringle5表达系统属于PRPL串联双启动子的高效原核基因表达系统,该系统可在4-5h内表达Kringle5蛋白占菌体总蛋白的34.8％,表达的量较高,经纯化、复性后获得的Kringle5蛋白具有抑制血管新生的生物学活性。
本研究构建的JM109/pBV220/Kringle5表达体系具有以下特点:①表达量高:在以上的研究中我们发现,该表达体系表达的蛋白占菌体总蛋白的34.8％,符合发酵生产需要；②该技术体系表达的Kringle5蛋白,其羧基端有6个组氨酸链,简化了该蛋白的分离、纯化的基因工程下游工艺,也使该技术体系对于获取该蛋白提供了简要的技术体系。③为该蛋白的产业化发展奠定了实验基础:本原核表达体系一方面保证了蛋白表达的量较高,使原料能合理利用,降低了生产成本；同时,使该蛋白的分离纯化体系简化,客观上为其产业化发展准备了条件。本研究为进一步将Kringle5蛋白开发成新型抗肿瘤药物奠定了实验技术基础。
2基因重组Kringle5蛋白的发酵制备工艺研究
本研究在本实验室成功构建了Kringle5的原核表达体系并证明获得的基因重组Kringle5蛋白具有抑制CAM血管生长活性的基础上,应用高密度发酵法建立并优化了Kringle5蛋白的发酵技术,采用比浊法检测菌体密度、称重法监测菌体重量、SDS-PAGE凝胶电泳检测Kringle5表达量。研究结果显示,Kringle5基因重组蛋白基因工程菌高密度发酵的优化条件为:取-70℃20％甘油保藏的BP-5菌种,立即置于水浴中溶解,在超净工作台内取灭菌接种环涂划含50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板,置30℃温箱过夜；从平板上挑取单菌落,接种于5mL LB中(含100μg/mL Amp),然后于30℃摇床振荡12h,成为活化一级发酵种子；取活化菌种,按1:50接种量接种于盛有300mL的LB的三角摇瓶中(含100μg/mL Amp),在空气浴摇床中,30℃、200r/min振荡培养12h,即为二级发酵种子液:发酵培养基选用LB-2×YT,体积均为3.0L,加3mL食用油作为防泡剂,在120℃灭菌20min后冷却至30℃；加Amp10g,接种子液300mL:细菌接种后30℃进行基础培养的时间为7h,以10mL/h的速度开始流加补料培养基,随后流加速度以10mL/h逐渐递加；于42℃加入诱导培养6h。pH由1mol/L HCl与25％氨水控制于7.0,空气流量为1vvm,溶氧控制始终大于50％,搅拌转速控制为800-1200r/min；经15％的SDS-PAGE电泳图像分析系统扫描分析,目的蛋白占到全菌总蛋白的38.4％,菌体干重达到14.28±0.11g/L。本研究建立并优化了Kringle5蛋白的原核高密度发酵工艺,为其新药开发奠定了技术基础。
3基因重组Kringle5蛋白的纯化工艺研究
固定金属亲和层析(IMAC)是近年来发展起来的一种亲和方法,其固定相基质上鳌合了一些金属离子,如Cu2+、Ni2+、Fe3+等,其配基为侧链含有Lys、Met、Asp、Arg、Tyr、Glu和His的多肽,特别是肽序列中含有His-X-X-X-His的结构最易结合到金属离子亲和柱上,纯化效果较好。本课题中,Kringle5的纯化方法的设计是基于其N端设计有6个His组成的His标签。His的咪唑环作为电子供体容易与固定的金属离子形成配位键,含有连续His残基序列的多肽可在IMAC中有效保留。基质材料洗涤之后可通过调节柱缓冲液的pH或添加游离咪唑洗脱含多聚His的多肽。本研究分别使用Chelating Sepharose Fast Flow填料,鳌合NiSO4后,利用Pharmacia Biotech GradiFrac控制台,分别采用pH梯度洗脱和咪唑梯度洗脱的方法探究了Kringle5的纯化方法。本实验中我们对两种不同的目的蛋白洗脱的方法进行了研究,我们优选pH梯度洗脱法对Kringle5进行纯化。
研究结果显示,用10倍柱体积的Binding Buffer E洗至基线平稳；将样品加到层析柱中,室温静止30min后流速控制在15ml/h左右,收集穿透部分；层析用5倍柱体积(约50ml)的Binding Buffer E洗,流速控制在30ml/h左右；分别用5倍柱体积(约50ml)ElutingBuffer F,Eluting Buffer G,Eluting Buffer H洗脱,流速控制在15ml/h左右,监测A280并收集洗脱液；经SDS-PAGE鉴定发现,上样峰中前部分为穿透峰,后半部分为非特意结合杂蛋白峰,洗脱峰均为Kringle5,蛋白纯度在98％以上,pH梯度洗脱的蛋白得率为62.7mg/柱体积。本研究建立的Kringle5纯化方法为后续Kringle5蛋白的生物学活性研究奠定了实验基础。
4基因重组Kringle5蛋白的药效学研究
纤溶酶原Kringle5能抑制内皮细胞增生,且其活性比血管抑素(即Kringlel-4,angiostatin)更强。Kringle5抑制血管生长因具有高效、高细胞选择性以及短的氨基酸序列的特点,而具有治疗血管增生性疾病的潜在临床应用价值。
4.1基因重组Kringle5抑制血管内皮细胞增殖的实验研究
本研究采用体外实验的方法用Kringle5和血管抑素干预VEC-304的生长,观察我室制备的原核表达Kringle5重组蛋白的药效学效果。实验结果显示:①本研究获得的基因重组Kringle5蛋白抑制VEC-300的ED50为0.25(0.06,0.88)μmol/L;②从Kringle5对VEC-304细胞结构的影响、对DNA的断裂作用、细胞膜和细胞核的变化、细胞周期的改变和Procaspase3的表达变化等5个方面的研究结果显示,Kringle5处理的VEC-304细胞表面微绒毛表现为脱落或消失；形成了显著的DNA Ladder且初步结果显示Kringle5的致凋亡作用有剂量依赖性；作用于VEC-30412h后出现为早期凋亡,作用3d后出现细胞核固缩、裂解；凋亡细胞的百分率、G0/G1期细胞数随Kringle5浓度的递增而增加,细胞被阻滞于G0/G1期；Kringle5蛋白对VEC-304细胞的致凋亡作用有时间依赖性,在作用4h后即出现凋亡的迹象,8—12h达到最大。证实了本工艺制备的基因重组Kringle5蛋白对血管内皮细胞的致凋亡作用。⑨采用Caspase3抗体等对其机制进行了研究,证实Kringle5诱导VEC-304细胞凋亡可能通过激活胞内的Caspase3介导的凋亡途径和阻遏细胞循环两条途径实现的。本研究为基因重组Kringle5蛋白的临床应用奠定了理论基础。
4.2基因重组Kringle5蛋白抑制内皮细胞迁移的实验研究
肿瘤组织内新生血管形成是由刺激血管生长因子诱导血管内皮细胞增殖和游走运动,从而诱生血管芽生成。内皮细胞作为血管形成因子的效应细胞,在肿瘤血管形成中起关键性的作用,所以对内皮细胞的增殖或迁移的干扰能力是有效的抗血管形成药物的重要特征。本研究采用缺损闭合实验、诱导VEC-304细胞迁移实验和体外血管形成实验检测Kringle5抑制VEC-304细胞迁移和体外血管形成效果,为其临床应用奠定实验基础。
本研究结果显示,100μmol/L的Kringle5作用后4d和6d两组缺损面积的差异具有显著性,随着干预时间的延长,缺损周围的VEC-304细胞在向缺损生长,但是Kringle5组的缺损面积却没有增大；加入条件培养基对内皮细胞作用6 h后,用U14细胞制备条件培养基1表现出对内皮细胞更强的吸引作用,细胞计数显著高于含有Kringle5蛋白的条件培养基,其抑制U14细胞条件培养基诱导的VEC-304细胞迁移的ED50为70.60(56.05,91.85)μmol/L；Kdngle5蛋白抑制VEC-304细胞迁移的ED50为36.44μmol/L；当有U14细胞存在时,迁移的细胞数明显增加,Kringle5蛋白使迁移细胞数显著减少,并呈剂量依赖性,Kringle5蛋白抑制U14细胞诱导的VEC-304细胞迁移的ED50为13.04(3.86,33.81)μmol/L；体外血管形成试验中,Kringle5组中VEC-304细胞形成的网格结构较小且有较多的VEC-304细胞并未参与形成网格结构而置于网格之间。说明Kringle5蛋白具有抑制血管生成的作用,其作用机制可能是通过抑制内皮细胞迁移和内皮细胞增殖,从而抑制新生血管生成。
4.3基因重组Kringle5蛋白对小鼠转移瘤的治疗效果评价
人们已致力于开发和研究破坏或抑制血管生成、有效地阻止肿瘤生长和转移的药物,这类药物可切断肿瘤赖以生长和转移的营养来源和迁移通道,具有良好的特异性、剂量小、疗效高、不易产生耐药性、对正常组织毒性极小等优点。本研究采用U14细胞悬液皮下种植建立小鼠移植瘤模型,将Kringle5蛋白直接在瘤体内注射,观察瘤体大小,小鼠活动能力、饮食等状况,以此来评价Kringle5蛋白治疗的抑瘤能力,为其临床应用奠定实验基础。
本研究结果显示,治疗各组小鼠治疗前后饮食、行为无明显异常,反应能力、营养状况良好；而阴性对照组小鼠随着瘤体的增大,饮食、活动能力、反应能力逐渐变差,营养差,后期呈恶病质态,在给药后第6天有1只小鼠死亡。初步说明本研究用Kringle5在荷瘤小鼠体内未引起明显的免疫反应,且对小鼠的生长状态有一定的改善作用。①从瘤体的生长速度分析,各治疗组瘤体在治疗后第5d增长速度即开始减慢,10d后体积增长明显减慢,第20d时Kringle5低剂量组和Kringle5高剂量组瘤体体积分别为(20270.00±527.18)mm3、(11993.33±229.75)mm3,其中低剂量组与Angiostatin组无显著性差异(P>0.05),而高剂量组的治疗效果优于Angiostatin组(P<0.01)；Kringle5高剂量+环磷酰胺组的瘤体体积为(7298.33±496.12)mm3,显著低于其他各组(P<0.01),说明Kringle5在肿瘤化疗的过程中与化疗药物同时使用效果可达最佳,且可减少化疗药物的副作用的发生。②从瘤体的重量角度分析,Kringle5低剂量组和Kringle5高剂量组瘤体重量分别为(4.78±1.34)g、(3.82±1.16)g,其中低剂量组与Angiostatin组的抑瘤效果相似(P>0.05),而高剂量组的治疗效果优于Angiostatin组(P<0.01)；Kringle5高剂量+环磷酰胺组的瘤体重量为(3.16±1.08)g,显著低于其他各组(P<0.01),说明Kringle5可抑制瘤体肿瘤细胞的增殖,其机制可能是减少瘤体组织的血供、促进瘤细胞的凋亡而致。③从瘤体中血管形成的角度分析,使用CD31单抗检测U14移植瘤中血管的形成和生长情况,可见阴性对照组(A组)的小鼠瘤体内有分布不
一、管腔不等的血管形成,而Kringle5高剂量组(D组)的血管形成明显减少,提示Kringle5具有抑制瘤体中血管新生的作用。
对瘤体组织中相关基因的表达检测结果显示,Kringle5可抑制VEGF、IL-8的表达,说明在使用Kringle5治疗肿瘤中可降低肿瘤中血管生长刺激因子的表达,对血管的新生有抑制作用,该结果与CD31单抗检测瘤体组织血管分布相一致,初步说明Kringle5的抑瘤作用是通过抑制血管新生来实现的。Kringle5可抑制MMP-2、MMP-9的表达,而促进TIMP-1、TIMP-2的合成,说明在使用Kringle5治疗肿瘤中可同时降低肿瘤细胞的侵袭能力,在抑制肿瘤侵袭周围正常组织中可能会起到重要作用。Kringle5蛋白可使瘤体中VE-cadherin表达量增加,而CD44V6的表达量减低,初步显示Kringle5蛋白可能在肿瘤细胞转移的过程中起重要的抑制作用。本研究阐明了Kringle5抑制小鼠移植瘤生长的效果和可能机制,为其临床应用奠定了实验基础。
5基因重组Kringle5蛋白的毒理学研究
本研究利用小鼠急性经口毒性试验、鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、大鼠30d喂养试验等毒理学试验方法检测基因重组Kringle5蛋白在动物体内的急性毒性、致突变作用和较长期接触毒性,为基因重组Kringle5蛋白的临床应用奠定实验基础。
本研究结果显示,基因重组Kringle5蛋白对两种性别的SPF级昆明种小鼠的经口毒性试验中,二次灌胃总量达12.0g/kg·bw,一周内动物未见中毒症状,无动物死亡,按急性毒性分级标准规定,基因重组Kringle5蛋白属实际无毒级。小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验三项致突变试验结果均为阴性,说明基因重组Kringle5蛋白无致突变作用。Wistar大鼠30d喂养试验结果表明:该受试物0.34、3.40、6.70g/kg·bw剂量分别相当于推荐人群日摄人量0.2g/kg·bw的20、50、100倍对Wistar大鼠的临床检查、血液学、生化学、脏器重量和系数以及病理组织学等指标无明显影响,未发现该受试物有明显的毒性作用。