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目的构建人核心蛋白聚糖(human decorin, hDCN)原核表达载体PGEX-4T-1-DCN,将重组质粒转化到婴儿双歧杆菌中,待其充分表达后,取培养菌上清液观察其对K562细胞的增殖、凋亡和细胞周期的作用。方法1.采用双酶切方法扩增并回收DCN基因片段,利用分子重组技术构建PGEX-4T-1-DCN原核表达载体,应用电转化法将重组质粒转化至双歧杆菌,并进行EcoR I、 Not I双酶切及测序鉴定。2.转化成功后提取上清液,处理K562细胞,于倒置显微镜下观察K562细胞增殖抑制状况、形态改变及细胞凋亡情况。3.10%、20%和30%培养菌上清液作用48h后,采用流式细胞仪检测K562细胞凋亡情况,并进行细胞周期阻滞分析。结果1.构建重组质粒经双酶切鉴定,所扩增基因片断与目的基因片断大小相符；测序后与Genbank中DCN基因序列(NT029419)相比对完全相符,没有发生突变。2.倒置显微镜下观察到DCN目的质粒转化双歧杆菌上清液组、空质粒转化双歧杆菌上清液组、单纯双歧杆菌上清液组细胞均出现凋亡形态学改变。其中DCN转化双歧杆菌组作用下细胞形态变化最为明显,可见细胞形状不规整,并有核碎裂、凋亡小体出现,细胞增殖明显减慢。3.流式细胞仪检测可见,单纯双歧杆菌上清液组与转化空质粒双歧杆菌上清液组可诱导K562细胞出现凋亡,早期凋亡率分别为11.26±1.54(%)和13.85±1.33(%),而转化DCN的双歧杆菌上清液组细胞凋亡率可达23.79±2.48(%),与前两组相比差异有统计学意义(P<0.01)。4.细胞周期分析结果表明,与对照组(5.04±0.78%)相比,G2/M期细胞比例在单纯双歧杆菌上清液组(10.56±0.81%)、空载体双歧杆菌上清液组(12.98±1.66%)及转化DCN双歧杆菌上清液组(13.37±0.74%)明显增高(P<0.01),有统计学意义：单纯双歧杆菌上清液组和空载体双歧杆菌上清液组Go/G1期分别变现为(65.59±1.54%,63.89±1.24%),相比较空白组(62.23±0.72%)无统计学意义(P>0.05),而DCN转化双歧杆菌上清液组Go/G1期为(72.24±0.54%),与其他三组相比,其差异有统计学意义(P<0.01)。结论1.成功构建了DCN基因原核表达载体PGEX-4T-1-DCN。2.应用电转化方法成功将外源性基因hDCN转化入婴儿双歧杆菌中。3.外源性基因DCN转化婴儿双歧杆菌后的表达产物对K562细胞有增殖抑制和凋亡诱导作用。4.婴儿双歧杆菌可使K562细胞发生G2/M期阻滞,而DCN转化入双歧杆菌后,可导致K562细胞同时发生G2/M和Go/G1阻滞,细胞生长在上述两个节点同时受阻,可以协同发挥较单独应用更强的抑制K562细胞生长和诱导其凋亡的作用。