论文部分内容阅读
甘草酸是甘草中主要活性成分,具有抗炎、保肝等药理作用,是临床上常用的保肝类药物,被广泛用于临床急、慢性肝脏疾病的治疗。现代医学认为,肝脏与肠道是密切联系的两个重要器官,它们之间存在着一条双向交流通路,称为“肠-肝”轴。由于“肠-肝”轴的存在,使得慢性肝脏疾病的发生发展与菌群失调存在密切联系。此外,甘草酸经口服给药后,需被肠道菌群糖苷酶水解为甘草次酸后才可被吸收入血,发挥药效。而研究表明,肠道菌群失调可能影响经肠道菌群代谢进而发挥药理活性的药物体内代谢处置、吸收和疗效。同时药物也会影响菌群功能、组成和结构,进而改善病症。因此,我们提出如下假说:甘草酸可改善慢性肝损伤引起的肠道菌群失调;肝损伤下肠道菌群失调可能导致甘草酸在胃肠道内代谢处置发生改变,导致其在体内药代动力学行为发生改变;改善菌群组成结构可影响甘草酸的生物转化与口服生物利用度。本课题采用腹腔注射50%四氯化碳橄榄油溶液方法建立大鼠慢性肝损伤模型,通过检测血清ALT、AST水平评估模型建立是否成功。大鼠灌胃给予甘草酸后,通过测定血清生化指标和观察肝脏组织病理切片,探讨甘草酸的保肝作用。实验结果显示,甘草酸可显著降低模型大鼠血清ALT、AST等肝功能指标,减轻肝细胞炎性浸润及纤维化,起到保护肝脏的作用。通过RT-PCR法测定肝损伤相关基因表达量,研究甘草酸保肝机制。结果显示,甘草酸可降低模型大鼠肝脏中TNF-α、LBP、TLR4等基因相对表达量,抑制炎症反应,起到保肝作用。研究发现,细菌脂多糖结合蛋白(LBP)和Toll样受体(TLR4)均可被细菌脂多糖(LPS)激活,促进肝损伤进展。因此,这提示我们甘草酸可能作用于肠道菌群,影响其组成结构。基于上述推测,本课题采用16S功能基因多样性测序技术对大鼠肠道菌群落多样性和组成结构进行测定分析,研究甘草酸对慢性肝损伤大鼠肠道菌群的影响作用。实验结果显示,肝损伤大鼠的肠道菌群组成结构发生了显著变化,主要表现为益生菌的减少和致病菌的增多。甘草酸可改善肝损伤导致的菌群失调,调节菌群多样性与组成结构,主要表现为显著增加Lactobacillus(乳杆菌属)相对丰度。16S功能预测结果显示,模型组大鼠中磷酸转移酶系统(PTS)和磷酸糖苷酶相对含量减少,甘草酸可增加PTS和磷酸糖苷酶相对含量。据报道,乳杆菌对皂苷类成分的脱糖基过程依赖于PTS。该结果再一次表明了甘草酸可增加乳杆菌属丰度,此外,根据这一结果我们推测乳杆菌属数量的增加可促进甘草酸生物转化与吸收,提高其生物利用度。根据上述实验结果推测,本课题建立了LC-MS法同时测定生物样品中甘草酸和甘草次酸的方法,借助该方法分析乳杆菌对甘草酸的体外代谢作用以及乳杆菌对甘草酸体内药动学的影响。实验结果显示乳杆菌属细菌(鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌和鼠乳杆菌)均可将甘草酸代谢成甘草次酸;正常大鼠与模型组大鼠体内甘草次酸的药动学参数有显著性差异,甘草酸在肝损伤大鼠体内吸收减少,口服生物利用度降低;灌胃给予乳酸杆菌后,大鼠体内甘草次酸的药动学参数均发生显著性变化。结果表明乳酸杆菌可将甘草酸转化为甘草次酸,并促进甘草次酸的体内吸收,增加甘草酸的生物利用度。为进一步研究乳杆菌对甘草酸吸收的影响作用及相关机制,本课题采用Caco-2细胞模型,探讨乳杆菌对甘草酸跨膜转运的影响以及甘草酸、甘草次酸对乳杆菌细胞粘附率的影响;采用荧光定量PCR技术研究乳杆菌对肠道相关转运蛋白基因表达的影响。实验结果显示,乳杆菌可促进甘草酸及甘草次酸的吸收,该结果与体内药动学实验结果一致;甘草酸和甘草次酸可增加乳杆菌对细胞的粘附性;乳杆菌可一定程度降低MDR1、P-gP、MRP-2基因相对表达量。结果表明,乳杆菌促进甘草酸和甘草次酸吸收的机制可能是甘草酸可增加乳杆菌对Caco-2细胞粘附性,乳杆菌粘附于细胞后降低了药物外排转运蛋白基因的表达,从而促进了甘草酸及甘草次酸的吸收。