构建重组杆状病毒的新方法及杆状病毒p74基因种属特异性研究

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杆状病毒作为一种广泛应用于蛋白表达和生物防治的工具得到了人们的重视.该文报道了一种利用大肠杆菌RecA基因介导的同源重组机制,在大肠杆菌中快速构建重组杆状病毒的新方法.与传统的构建重组杆状病毒的共转染法相比,该方法无须空斑纯化等烦琐的过程,因此更加简便和快速,同时,利用该方法,人们还可获得以前共转染法无法获得的杆状病毒必须基因缺失株,从而为这些必须基因的功能研究提供了方便.用该方法构建一个重组杆状病毒仅须一到两个星期.1997年,Yang等在研究如何修饰细菌人工染色体(Bacterial Artificialchromosome BAC)时,首次利用大肠杆菌RecA基因可以介导同源重组的功能,通过用温度和双抗生素的交替筛选,巧妙地完成了对BAC中大片段DNA的改造.2001年,Lalioti等又对该方法进行了优化,将原来与欲修饰基因片段在同一个质粒上的RecA基因分离出来,改由质粒pDF25提供,以减少RecA蛋白在大肠杆菌中的表达时间,增加BAC DNA的稳定性.该文在此基础上进一步改进了该方法,通过增加一步使用单一抗生素和温度的筛选,大大降低了原方法使用温度和双抗生素筛选时的背景菌落,从而省去了原方法中必须要用PCR或Southern杂交来验证共整合子这一步,因而更加简便. 经生物测定结果显示,AcMNPV Bacmid-polhSL74无法通过口服方式感染AcMNPV敏感昆虫银纹夜蛾,说明SpltMNPV p74基因无法替代AcMNPV p74基因功能,即p74基因具有种属特异性.同时,AcMNPV Bacmid-polhAS、AcMNPV Bacmid-polhSA也无法通过口服方式感染银纹夜蛾,表明p74基因的种属特异性既包含了p74基因膜外区,又包含了膜内区.
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