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硒是一种重要的生物必需微量营养素,在禽类的生长发育、繁殖、免疫功能及抵抗疾病等方面发挥着重要生物学功能。其利用终止密码子UGA为编码密码子,以Sec形式掺入到硒蛋白的多肽链中发挥生物学作用。SelW是动物体内硒蛋白家族的重要成员之一,最早发现其与动物硒缺乏病的发病机制相关,得到了科学界广泛关注。到目前为止,SelW的确切生物学功能仍然没有被准确的界定。当前小鼠,大鼠,猕猴,人,绵羊,猪,罗非鱼等物种的SelW基因序列均已被克隆,然而禽类SelW的相关信息仍然不清楚。本研究应用分子生物技术从雏鸡大脑组织中克隆并鉴定了鸡SelWcDNA全序列;利用生物信息学方法预测了SelW蛋白结构和功能;利用基因工程技术在原核表达系统中表达了SelW并制备了多克隆抗体;以种蛋、鸡胚、雏鸡和育成公鸡为实验对象,利用荧光定量PCR方法测定了饲料与组织中硒含量对神经内分泌组织中SelW及硒蛋白合成代谢相关酶SecS与SPS1 mRNA表达的影响,同时也检测了成年公鸡及成年母鸡神经内分泌组织中SelW、SecS与SPS1mRNA表达差异,结果表明:
(1)成功克隆获得了全长为834bp的鸡SelW cDNA全序列(GenBank登录号GQ919055),其包含5-UTR、一个完整的ORF、3-UTR、起始密码子为ATG、终止密码子为TGA,编码Sec的密码子TGA位于113-115位,3-UTR中含SECIS元件和AATAAA,其蛋白由85个氨基酸组成,第10位为Cys,第13位为Sec,RT-PCR检测表明SelW在鸡器官组织中广泛表达。
(2)生物信息学分析表明鸡SelW蛋白分子量为9.3217kDa,具有3个亲水区域,蛋白质空间结构中含有4股B折叠,2个外在的a螺旋,形成β(3-10)-α1(16-29)-β2(34-39)-p3(47-52)-β4(55-61)-α2(69-81)的二级结构,其中β1与β2是平行的,与α1共同形成SelW家族共有的β1-α1-β2基序;预测其属于EC 1.11.1.9,可能具有GPx家族成员的功能,此外该蛋白第9-16、18、41-47、66位氨基酸残基可与DAAO结合,推测DAAO可能成为鸡SelW的靶点分子。
(3)利用重叠延伸PCR方法将编码Sec的密码子TGA突变为TGT,制备突变型鸡SelW,在大肠杆菌表达系统中成功表达了6-His-突变型SelW融合蛋白;同时,以人工合成的鸡SelW多肽为抗原成功制备了兔抗鸡SelW多克隆抗体。
(4)测定了鸡胚神经元细胞内的SelW、SecS、SPS1 mRNA半衰期分别为12.85h、4.48h与12.10h,并解释高浓度硒能够损害其mRNA的稳定性,低浓度硒可以增加其mRNA的稳定性,这是硒对SelW基因转录后调控的分子机制之一。
(5)在鸡胚脑组织和雏鸡神经内分泌组织的发育过程中SelW、SecS和SPS1mRNA表达存在显著差异,种蛋硒含量和饲料硒浓度能够干扰组织中这些基因转录水平,提示SelW、SecS和SPS1在鸡胚和雏鸡神经内分泌组织发育中发挥着重要作用,而鸡胚和雏鸡神经内分泌组织中SelW mRNA表达水平对种蛋和饲料硒含量变化呈现出敏感应答模式。
(6)饲料中低水平的硒含量能够增加育成公鸡神经内分泌组织中SelW、SecS和SPS1 mRNA表达水平,而饲料中过量的硒含量能够下调这些基因的转录水平,性别也能够影响成年鸡神经内分泌组织中这些基因mRNA表达水平,而育成公鸡脑区组织中SelW mRNA表达水平与全血硒含量呈现极显著的正相关性。