【摘 要】
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目的探讨胃饥饿素（Ghrelin）在成骨细胞内质网应激中的作用及其可能机制。方法（1）构建内质网应激模型体系:在参考文献以及以往研究的基础上,用不同浓度（0-8.0μg/m L）衣霉素（Tunicamycin,TM）处理20h,诱导MC3T3E1成骨细胞系,经CCK8的测定,明确后续研究中TM的实验浓度;（2）设立不同浓度Ghrelin预处理组(10-11、10-9、10-7mol/L),比较不同
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目的探讨胃饥饿素（Ghrelin）在成骨细胞内质网应激中的作用及其可能机制。方法（1）构建内质网应激模型体系:在参考文献以及以往研究的基础上,用不同浓度（0-8.0μg/m L）衣霉素（Tunicamycin,TM）处理20h,诱导MC3T3E1成骨细胞系,经CCK8的测定,明确后续研究中TM的实验浓度;（2）设立不同浓度Ghrelin预处理组(10-11、10-9、10-7mol/L),比较不同浓度预处理4h,对TM诱导的内质网应激凋亡及其活性氧生成的影响,选取合适的Ghrelin浓度作后续实验;（3）设立对照组及GSK621（AMPK激动剂）和/或Ghrelin与处理组,比较AMPK激动剂GSK621预处理3h,Ghrelin处理4h,后TM处理20h后各小组的细胞凋亡发生率以及活性氧的产生情况;（4）q RT-PCR技术检测不同处理组内内质网应激标志基因的转录水平（Bip、Chop、IRE1α）,探讨Ghrelin对TM诱导的内质网应激的作用以及可能的机制;（5）运用蛋白印迹分析各组内Bip以及p-AMPK的水平,使用GSK621预处理细胞,探讨Ghrelin与AMPK通路和内质网应激的关系。各组实验均独立重复三次。结果（1）CCK8测定显示,细胞存活率为50%时,TM的药物浓度处于1.0-2.0μg/m L之间,后续实验选取1.5μg/m L作为内质网应激的造模浓度,1.5μg/m L的TM处理组细胞凋亡率以及活性氧水平显著升高（C vs TM,P=0.000）;（2）与单独TM处理组相比,经10-11mol/L的Ghrelin预处理4h后,凋亡率(TM vs G10-11M+TM,P=0.003)和活性氧(TM vs G10-11M+TM,P=0.002)水平明显下降。另外,Ghrelin的这种作用,具有明显的浓度依赖性,随着浓度的增加而增强（P=0.000）;（3）Ghrelin预处理的GSK621+TM组与GSK621+TM组相比,凋亡率以及活性氧产生均显著下降(GSK621+TM vs GSK621+G10-7M+TM,P<0.001);（4）与对照组相比,TM处理组内质网应激相关标志性基因——Bip、Chop、IRE1α,m RNA的表达水平均显著增加（C vs TM,P<0.01）。仅Ghrelin单独处理组与对照组相比,上述相关基因表达水平差别不具有统计学意义(C vs G10-7M,P>0.05)。与TM组相比,Ghrelin与TM共处理组相关基因表达水平显著下降(TM vs G10-7M+TM,P<0.05)。Ghrelin预处理的GSK621+TM组相较于GSK621+TM组内质网应激相关基因表达也显著下调(GSK621+TM vs GSK621+G10-7M+TM,P<0.001);（5）蛋白印迹结果显示,TM组p-AMPK和Bip水平有明显的增加,而Ghrelin预处理后AMPK磷酸化和Bip水平下降(TM vs G10-7M+TM,P<0.05);相较于GSK621+TM组,经Ghrelin预处理组的GSK621+Ghrelin+TM组Bip和p-AMPK的表达显著下调(GSK621+TM vs GSK621+G10-7M+TM,P<0.05)。结论胃饥饿素能够呈剂量依赖性改善衣霉素诱导的内质网应激,其可能通过或至少部分通过抑制AMPK磷酸化,改善衣霉素诱导的MC3T3E1细胞内质网应激所介导的凋亡。
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