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本文通过筛选抗电离辐射光自养微藻,研究了蓝藻抗电离辐射特性与机制,特别是强电离辐射下的DNA修复与保护特性以及相关的生理生化响应。在此基础上,探索抗辐射蓝藻的生物多样性规律和起源演化过程,为抗辐射极端生物学理论及其相关的应用技术积累重要的实验基础。研究内容如下:
⑴以60Co作为辐射源,5.0kGy为筛选剂量,从13株微藻中分离筛选得到7株抗电离辐射微藻,其中6株蓝藻,1株硅藻。经初步的鉴定,抗电离辐射蓝藻分别是:钝顶螺旋藻Spirulina Platensis、席藻Phormidium sp.M2、席藻Phormidiumsp.M3、鲍氏织线藻Plectonema boryanumUTEX485、拟色球藻Chroococcidiopsis sp.A1、拟色球藻Chroococcidiopsis sp.A2,该结果说明抗电离辐射蓝藻资源广泛的存在。
⑵2.5kGy处理后,鲍氏织线藻UTEX485藻丝体存活率高达80.0%;剂量为5.0kGy-7.5 kGy时,存活率仍高于70.0%;D10介于7.5kGy与10.0kGy之间;15.0kGy为致死剂量。席藻M2在2.5kGy-15.0kGy之间的存活率均保持在90.0%以上,17.5kGy处理,存活率高达33.3%,当剂量为20.0kGy时,没有检测到存活的藻丝体,D10介于17.5kGy与20kGy之间,是目前已报道抗电离辐射特性最强的光合生物,并接近耐辐射球菌Deinococcus radiodurans的抗性。
⑶经5kGy电离辐射处理后、DNA抽提和普通琼脂糖凝胶电泳分析显示,鲍氏织线藻UTEX485与席藻M2的抽提DNA片段均达到50kb以上,进一步脉冲场琼脂糖凝胶电泳分析表明,鲍氏织线藻UTEX485辐照后的最大DNA片段可以达到200kb。鲍氏织线藻UTEX485及席藻M2对DNA辐射损伤的保护能力均超过其它已报道的抗辐射微生物。
⑷用琼脂糖包埋法提取的鲍氏织线藻UTEX485 DNA经脉冲场琼脂糖凝胶电泳分析发现,其修复能力比其它抗电离辐射生物稍弱,需要3—4天才出现DNA原位带,同时出现至少3条DNA修复带。自恢复培养第6天至完全恢复的第16天,DNA带与对照样相比,原位带没变,而且增至4条保持稳定且大小在150kb-1900kb之间的DNA带,这极有可能是形成了多了染色体共存的细胞。说明了鲍氏织线藻UTEX485在基因组水平形成了特殊修复过程,与其它抗辐射生物DNA修复的高度保真性截然不同。
⑸辐射剂量为2.5kGy、5kGy时,对鲍氏织线藻UTEX485藻丝体的吸收光谱没有明显的影响;可溶性蛋白、C-藻蓝蛋白(CPC)与别藻蓝蛋白(APC)相对含量含量略有升高,可溶性蛋白分别提高2.61%、8.29%,CPC分别提高了7.78%、0.58%;APC含量的升高较为显著,分别提高3.35%和10.94%;SOD的活性稍有降低,降低了4.04%和8.62%;与SOD不同,CAT酶活性在较高剂量辐照处理后反而升高,当剂量为2.5kGy时提高了6.60%,当剂量为5.0kGy时,其活性高于2.5kGy,提高了14.65%;类胡萝卜素的含量降低3.49%、7.72%:叶绿素A含量略微下降,分别降低1.7%、4.9%。别藻蓝蛋白含量及CAT活性显示出随辐射剂量增加而增加的趋势。
⑹采用羟基磷灰石柱层析分离得到鲍氏织线藻UTEX485的CPC有2个保留时间显著不同的组分(组分A,组分B),虽然OD620/280均>4,可见光光谱特征也基本一致,但其中组分A的室温荧光光谱特性特殊,荧光激发峰有三个:分别位于439nm、506nm和584nm,荧光发射峰位于680nm,与典型的CPC荧光光谱显著不同,因而推测该CPC组分可能具有特殊的结构特性,该特性或与电离辐射下鲍氏织线藻UTEX485的DNA保护能力有关,这一假设有待更深入的研究。
⑺鲍氏织线藻UTEX485藻胆蛋白粗提液清除超氧阴离子、羟基自由基,清除能力随着藻胆蛋白浓度的升高而提高,纯化的CPC、APC对O2-自由基具有很强的清除能力,对HO自由基的清除作用稍弱。藻胆蛋白的高含量和对氧自由基的高效清除能力表明,藻胆蛋白在藻丝体抗辐射生理中可能起到非常重要的作用。
⑻以上结果显示,蓝藻存在着对强电离辐射极强的保护作用与十分独特的DNA修复过程,其抗辐射特性的起源与演化过程与机制也必然存在特殊性,有关特性将具有独特的生物学意义和重要的研究价值,有待更深入的探索和发现。