论文部分内容阅读
背景:CTNNB1基因编码的β-catenin蛋白在Wnt/β-catenin信号通路中扮演着核心角色,虽然进化上高度保守,但功能却丰富多样。其在多种疾病的发生发展中都发挥着重要的作用,在恶性肿瘤中更是突出,并与人类肝肿瘤的大小、转移及临床分期有一定的关联。β-catenin蛋白的“DSGΦXS结合域”是与E3泛素连接酶β-Tr CP结合的关键区域,决定着β-catenin后续的泛素化降解情况。已有研究表明“DSGΦXS结合域”中的S45、D32、T41、G34、S33和S37六个氨基酸残基位点发生突变会对β-catenin的稳定性产生影响,进而改变细胞的增殖、迁移和分化等生物学功能。日本山梨县立中央病院Yosuke Hirotsu教授通过靶向深度测序分析技术对9例病毒性肝癌患者的肿瘤组织样本进行全基因组外显子测序,首次发现β-catenin蛋白的第36位的亲水性氨基酸残基组氨酸(H)被疏水性氨基酸残基脯氨酸(P)取代,且H36P的突变比占比为42%,鉴于此,我们对H36P-β-catenin新发突变体展开相关探索。目的:探讨H36P-β-catenin蛋白突变体在肝癌细胞中的稳定性,核转位情况,及其对离体肝癌细胞的生物学功能的影响。方法:首先在在p-CMV5真核表达质粒载体上构建WT-CTNNB1、G34R-CTNNB1、H36P-CTNNB1的基因克隆,用瞬时转染法将相应质粒分别转入人离体肝癌细胞株Hep G2和Huh7。其次,通过Western Blotting检测对比WT-CTNNB1、G34R-CTNNB1、H36P-CTNNB1克隆质粒的表达水平。再次,应用核糖体转录抑制剂CHX(放线菌酮)处理后检测对比WT-β-catenin、G34R-β-catenin和H36P-β-catenin的泛素化降解情况,即蛋白结构稳定性分析;再应用核浆分离实验检测H36P-β-catenin的核转位能力。最后应用cck8和Ed U细胞增殖实验检测36P-β-catenin对Hep G2和Huh7细胞增殖能力的影响。结果:肝癌细胞Hep G2和Huh7中,β-catenin蛋白新发突变体H36P与对照组即野生型β-catenin蛋白在表达水平相比未见异常,但整个蛋白结构的稳定性有所增强,即泛素化降解可能受阻,且发生核转位的H36P-β-catenin蛋白增多,一定程度上促进了Hep G2和Huh7细胞的增殖能力。结论:我们发现肝癌细胞中H36P突变型对β-catenin的总蛋白表达水平无明显改变,但其稳定性提高,核转位增强,并促进Hep G2和Huh7的细胞增殖。