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研究背景：随着社会经济和交通运输的发展,骨折的发生率逐渐增高,因颌面部的位置暴露,骨骼框架内以腔隙为主,是外伤后骨折的好发部位。影响骨折愈合的因素有很多,包括骨折类型、骨折部位、局部血液供应、患者年龄和健康状况以及医源性因素等。虽然大多数骨折在解剖复位及固定治疗后可以良好愈合,但仍然有约5%至10%左右的患者骨折发生延迟愈合或骨不连。颌面部骨折以及骨缺损会直接影响患者的功能和外形的美观,颌面部骨是面部外形的基础,受损后会影响患者的咀嚼和发音等功能,严重影响生活质量。引起骨缺损的主要病因包括：创伤、肿瘤及术后、感染和某些与骨组织相关的先天性疾病等。许多体外及动物实验研究发现,PDGF(血小板源性生长因子)通过血小板释放等方式在创伤区域出现较早,促进成骨相关细胞的迁移和募集以及细胞的增殖：在体内实验中发现PDGF-BB可以通过促进血管形成、促进糖尿病动物模型中的骨折愈合以及细胞的迁移,并且可以用于治疗骨质疏松症。然而,PDGF-BB对破骨细胞形成的作用还没有明确的结论。骨愈合是一个复杂的、包含多个阶段的过程,创伤后许多生长因子和细胞因子通过血液扩散或细胞分泌等方式聚集于骨折区域。不同的细胞因子分别在不同阶段的参与并促进骨折的愈合。目前临床及实验中修复骨缺损的方法,主要包括骨组织的自体移植、同种异体移植、异种骨移植和人工材料植入,以及口腔颌面部常用的牙槽骨的引导骨再生技术、牵张成骨、赝复体修复和组织工程技术等。骨组织工程技术作为一种有效手段被广泛应用于骨缺损的研究与治疗中。研究目的：通过研究PDGF-BB在体外细胞实验中对间充质细胞、成骨细胞和破骨细胞等细胞的生物学功能的调节作用,及调控成骨细胞-破骨细胞共培养体系中细胞生物学功能的作用及其机理。研究与探讨PDGF-BB在体外对间充质细胞和成骨细胞增殖、分化和矿化等作用的调节作用,对RAW264.7细胞系及BMMs(骨髓单核巨噬细胞)形成破骨细胞的作用及机制,以及在成骨细胞-破骨细胞共培养条件下PDGF-BB调节成、破骨细胞间的相互作用及机制；构建大鼠下颌骨骨折愈合模型,研究PDGF-BB在体内实验中调节破骨细胞形成的作用,并探讨PDGF-BB在大鼠下颌骨骨折愈合过程中的生物学作用及机制；以期发现PDGF-BB对骨折愈合的调节作用并探讨其机制;构建缓释PDGF-BB的生物学支架材料,研究材料的缓释性能和生物相容性,及促进大鼠颅骨缺损愈合的作用,为指导临床中应用组织工程方法治疗骨缺损提供实验和理论依据。材料与方法：1、通过体外分离培养原代小鼠骨髓间充质细胞、原代成骨细胞、原代单核细胞以及RAW264.7(小鼠单核巨噬细胞系)等细胞,来研究PDGF-BB对于骨髓间充质细胞、成骨细胞和破骨细胞的生物学作用。(1)取小鼠髓腔骨髓基质细胞,进行原代骨髓间充质细胞培养,研究PDGF-BB对于细胞多向诱导分化、细胞增殖和相关基因表达的影响；(2)采用骨组织块法,培养原代成骨细胞,研究PDGF-BB对于细胞成骨分化、增殖和成骨分化相关基因表达的作用；(3)培养原代单核细胞及RAW264.7细胞系,研究PDGF-BB调节破骨细胞形成和破骨细胞前体细胞趋化性的作用及其机制,实验中使用PDGFR-β抑制剂(AG-1295)、JAK2抑制剂(AG490)以及STAT3抑制剂(S3i-201)等来阻断相关信号通路,进一步探讨和分析在体外实验中对破骨细胞形成的影响；(4)构建成骨-破骨共培养体系,研究PDGF-BB在成骨-破骨间的相互关系及其机制。2、构建较为完善的下颌骨骨折模型,然后利用该模型通过组织学及影像学检查等方法,研究PDGF-BB对于下颌骨骨折愈合的作用。(1)通过体外测量与评估下颌骨形态及骨质,设计并制作不同类型的下颌骨骨折模型,通过组织学、影像学方法评估下颌骨骨折模型的情况,选择其中模拟骨折愈合过程最优的模型,用于进一步的实验研究；(2)利用构建下颌骨骨折模型,术后1、2、3周等时间点进行TRAP染色,研究PDGF-BB在动物实验中对破骨细胞形成的调节作用；(3)结合下颌骨骨折模型,设计对照组及局部应用PDGF-BB的实验组,术后于不同的时间点取材,通过组织学及影像学检测,研究PDGF-BB对骨折愈合的影响。3、设计并制作壳聚糖复合介孔硅纳米材料的复合支架,研究负载rhPDGF-BB(重组人血小板源性生长因子)的壳聚糖-介孔硅复合支架材料修复大鼠颅骨缺损的能力。(1)将壳聚糖和介孔硅两种材料混合,采用冷冻干燥法将材料制作成型并负载PDGF-BB蛋白,构建不同配比的壳聚糖和SBA-15复合材料,使用扫描电子显微镜观察支架材料的表面微结构；(2)并通过体外实验研究材料的细胞毒性、生物相容性：通过CCK-8细胞活性测定和矿化诱导后的茜素红染色评价PDGF-BB对骨髓基质细胞增殖和成骨分化的作用；并研究复合支架的体外缓慢释放PDGF-BB蛋白的能力；(3)构建大鼠临界颅骨缺损模型,在骨缺损中植入不同分组的材料,术后使用半定量X线检查、显微CT和组织学等方法检测大鼠颅骨缺损模型中的新骨形成,评估复合支架材料促进骨缺损愈合的能力。结果：1、PDGF-BB能促进骨髓基质细胞的增殖,以及部分成骨细胞分化相关基因转录水平增加,促进了骨髓基质细胞的成骨分化与矿化形成能力；在成骨诱导后期使用PDGF-BB对于间充质细胞矿化无明显的促进作用,前期给予PDGF-BB与诱导过程中全程加入PDGF-BB无明显区别：PDGF-BB能促进小鼠原代成骨细胞中碱性磷酸酶、骨钙蛋白、骨钙素、Runx2核转录因子、骨形态形成蛋白等与成骨相关的基因转录水平的增高,与血管生成和细胞迁移能力相关的金属基质蛋白酶-9基因的转录水平也明显增加。同时,P13K抑制剂LY294002能抑制甚至下调这些基因的转录水平；2、PDGF-BB能促进破骨细胞形成,同时这种促进作用能够被JAK2抑制剂AG490、PDGF-Rβ抑制剂AG-1295以及STAT3抑制剂S31-201所降低；PDGF-BB在体外细胞实验中能促进破骨细胞形成,而AG490和AG1295抑制这种作用。PDGF-BB促进了RAW264.7细胞中ERK1/2,Akt和STAT3的磷酸化。AG490能抑制PDGF-BB诱导的STAT3磷酸化；PDGF-BB上调了破骨细胞生成相关信号分子NFATc1、DC-STAMP和BCL-2的表达,AG-1295、AG490和S3I-201能降低该促进作用；PDGF-BB增强RAW264.7细胞迁移作用,通过促进破骨细胞前体细胞趋化增强破骨细胞形成,PDGF-BB促进MMP-9蛋白的表达,PDGFR-β抑制剂和JAK2抑制剂能抑制PDGF-BB促进细胞迁移的作用；3、在成骨细胞-破骨细胞共培养体系中,PDGF-BB对破骨细胞形成的促进能力较直接作用于破骨细胞的条件下有所下降,其可能的机制是PDGF-BB促进成骨细胞合成并分泌一氧化氮,从而抑制破骨细胞的形成。PDGF-BB促进成骨细胞形成一氧化氮的作用,能够被JAK2抑制剂AG490、PDGF-Rβ抑制剂AG-1295、STAT3抑制剂S31-201以及iNOS抑制剂SMT所逆转；此外PDGF-BB能促进成骨细胞MCP-1的表达,在加入PDGF-Rβ与JAK2/STAT3的抑制剂能够抑制这种促进作用；4、通过测量并评估下颌骨的骨质情况及解剖结构,我们设计了下颌骨下缘入路和构建的下颌骨骨折模型,并通过评估三种不同大鼠下颌骨骨折的术后组织学、影像学表现,以及力学性能,来选择最优的骨折模型,用于之后的实验研究。在骨折模型的评估中我们发现,裂隙组能够比较好的模拟骨折愈合的生物学过程,即血肿形成、血肿机化、纤维骨痂形成和骨性骨痂形成这一过程；而且该模型的可重复性和统一性较好,能够保证实验研究的大样本量和实验数据的可重复性与各组间数据的可比性；此外,结合我们对于正常愈合情况下,骨折愈合在组织学上的表现研究,我们发现该下颌骨骨折模型除了研究骨折愈合过程外,还可以用于研究骨折愈合过程中破骨细胞的形成；5、结合我们构建的下颌骨骨折愈合模型,我们发现PDGF-BB在体内实验中促进破骨细胞的形成。骨折愈合第1周,在对照组中未发现破骨细胞形成,而PDGF-BB组有明显的破骨细胞形成,说明PDGF-BB促进了破骨细胞形成;PDGF-Rβ抑制剂AG-1295.JAK2抑制剂A6490明显抑制了PDGF-BB所促进的破骨细胞形成。在大鼠下颌骨折愈合的第2周,破骨细胞形成量与PDGF-BB组与对照组相比明显增加,AG-1295和AG490组均抑制了破骨细胞形成；将外源性PDGF-BB应用于骨折区域,在组织学与影像学检查中均发现,PDGF-BB促进了骨折的愈合。6、壳聚糖/SBA-15复合支架材料具有理想的促进骨再生的潜质,具有良好的孔隙率与应力学性能,在体外实验中壳聚糖/SBA-15复合支架材料对大鼠骨髓基质细胞无明显的细胞毒性,能有效保证PDGF-BB以持续和稳定的方式释放；在体外细胞实验中,负载rhPDGF-BB的复合支架在具有良好的生物相容性,复合支架材料的缓释浸出液促进大鼠骨髓基质细胞的增殖和成骨分化：在大鼠颅骨缺损模型中,通过对半定量X线和Micro-CT等影像学检查结果和组织学检查结果的评估,表明负载rhPDGF-BB的壳聚糖/SBA-15复合支架材料可以促进大鼠颅骨临界骨缺损中新骨形成,其中CTS/S20组中新骨形成量显着大于其他组。结论：1、PDGF-BB能够促进间充质干细胞的增殖及促进其矿化,促进成骨细胞的增殖与分化；并且能够通过PDGF-Rβ-JAK2-STAT3通路来直接作用并促进破骨细胞的形成；PDGF-BB在成骨细胞-破骨细胞共培养体系中能够通过JAK2-STAT3通路促进成骨细胞分泌一氧化氮等产物,从而间接抑制破骨细胞的形成；PDGF-BB能促进破骨前体细胞的迁移,这可能与PDGF-BB促进MMP-9和MCP-1蛋白的表达有关；2、我们设计的下颌骨骨折模型可以用于研究骨折愈合过程,以及骨折愈合过程中破骨细胞的形成；PDGF-BB能促进体内破骨细胞的形成,这一促进作用与PDGF-Rβ-JAK2-STAT3通路相关;PDGF-BB能促进大鼠下颌骨骨折模型的愈合；3、负载rhPDGF-BB的壳聚糖-介孔硅复合支架具有良好的生物活性和生物相容性,具有良好的促进细胞粘附能力,这一支架作及组织工程方法有望在不断改进后能应用于颅颌面部大面积骨缺损的治疗。