论文部分内容阅读
近年来由于鱼油短缺导致植物油大量应用在水产动物饲料中。在提高经济效益和饲料生产产量的同时,植物性油源由于其脂肪酸营养不平衡,尤其是长链脂肪酸和n-3型脂肪酸的缺乏,导致了鱼类生长性能下降和营养代谢性疾病的多发,影响水产养殖业健康持续发展。因此,油源替代需要更为可靠的鱼类脂代谢生理学研究基础的支持。然而,由于鱼类种类众多,代谢模式各异,而相关研究又极为有限。事实上存在多种营养背景相对清晰但脂肪酸需求差异较大的代表性鱼类,如草鱼和罗非鱼就是n-3型和n-6型必需脂肪酸需求型的鱼类的典型代表,但鲜有相关脂代谢模式研究。因此基于已有的研究,本论文将对以下几个科学问题进行讨论:1)n-3型和n-6型脂肪酸需求型鱼类脂肪酸代谢模式分别如何,异同点在哪里?2)n-3型和n-6型脂肪酸需求型鱼类脂肪酸代谢模式在不同类型细胞内代谢差异是否一致?3)长链饱和脂肪酸在不同脂肪酸需求型鱼类中代谢情况是否相同?针对以上问题,本文将通过分别建立草鱼和罗非鱼肝、肌原代细胞模型,使用放射性标记脂肪酸追踪其在参与细胞脂肪酸摄取、脂肪酸β氧化、脂肪酸酯化等关键脂代谢过程并精确定量,同时检测脂代谢关键基因及调控因子基因/蛋白表达量,全面描述LCFA在不同鱼类细胞中的脂代谢模式异同点。本文主要研究结果和结论如下:1细胞模型建立细胞模型较为稳定、重复性好,是研究鱼类特定组织器官脂代谢的优良模型选择。本章首先探索对草鱼和罗非鱼肝原代细胞和肌原代细胞适宜的提取和培养方法,通过对脂肪酸共孵育浓度和时间的探索,确定适合研究鱼类细胞脂肪酸代谢的条件。通过胶原酶消化法,获得了草鱼和罗非鱼肝原代细胞,适宜培养条件为:含10%FBS+1%P/S的DEME高糖培养基;通过组织块培养法,获得了草鱼和罗非鱼肌原代细胞,并通过对FBS和糖水平的摸索,适宜的传代培养基为:含20%FBS+1%P/S的DEME低糖(1g/L)培养基。接着使用棕榈酸摸索了适宜的脂肪酸与四种细胞共孵育实验的浓度和时间,结果表明24h以内,脂肪酸浓度为100μmol/L适宜作为探究LCFA对鱼类细胞脂代谢影响的条件。2草鱼和罗非鱼肝细胞对长链脂肪酸的细胞代谢机制研究在建立的草鱼和尼罗罗非鱼肝原代细胞模型后,本部分实验使用标记脂肪酸示踪等技术,对肝细胞长链脂肪酸吸收、同化及异化代谢的重要过程进行定量检测,同时检测脂代谢关键基因及调控因子基因/蛋白表达量,探究n-3和n-6脂肪酸需求型鱼类脂代谢模型及其差异关键点。结果表明,LNA对草鱼FA脂肪酸积累效应强于LA,主要是通过提高LCFA摄取和脂质沉积效应实现的;而LA对罗非鱼LCFA摄取、β氧化过程均强于LNA,说明LA在罗非鱼肝内同化异化作用均较强,最终并未表现出对两种PUFA差异化的沉积效应。而饱和脂肪酸相较于PUFA只在脂肪酸摄取过程中占据优势地位,而包括脂肪酸β氧化、脂质沉积等胞内重要的代谢过程参与度较低,但也在一定程度上对草鱼脂质分泌和脂代谢调控有影响。除LCFA吸收这一过程之外,PUFA均主导了草鱼和罗非鱼脂代谢的多数过程。综上草鱼和罗非鱼肝细胞脂代谢的关键代谢差异点主要体现在脂肪酸摄取过程和酯质沉积,并最终影响总脂在肝细胞内的沉积,具体表现为草鱼偏好LNA摄取沉积,罗非鱼通过提高对LA的同化和异化代谢导致其最终与LNA在肝内沉积无显著差异。3草鱼和罗非鱼肌细胞对长链脂肪酸的细胞代谢机制研究在建立的草鱼和尼罗罗非鱼肌原代细胞模型后,本部分实验使用标记脂肪酸示踪等技术,对肌细胞长链脂肪酸吸收、同化及异化代谢的重要过程进行定量检测,同时检测脂代谢关键基因及调控因子基因/蛋白表达量,探究n-3和n-6脂肪酸需求型鱼类脂代谢模型及其差异关键点。结果表明,两种鱼肌肉细胞对PUFA的摄取能力较强,但代谢消耗能力弱于PA,最终导致PUFA在肌肉细胞中的沉积,尤其以罗非鱼肌细胞较为显著。而LA和LNA在肌细胞中的代谢差异较为显著,草鱼肌细胞在对LNA高摄入而低氧化的情况下最终脂肪酸沉积与LA组并无差异,罗非鱼肌细胞出现了同样的结果。综上相较于PUFA,PA主导了罗非鱼肌细胞脂代谢的过程,而对草鱼并无显著影响。草鱼和罗非鱼肌细胞PUFA代谢的关键差异点主要体现在对PPARa激活作用的强弱,其在草鱼肌细胞中主要被LNA激活,在罗非鱼肌细胞中LA略强于LNA。综合三种脂肪酸对肝和肌细胞脂代谢的影响,我们阐明了不同类型LCFA在两种鱼类不同细胞类型中的代谢特点:1)n-3PUFA在草鱼肝细胞中有较好的代谢和积累能力,并且对肌细胞脂肪酸异化代谢有激活作用;2)n-6PUFA在罗非鱼肝细胞中有较好的代谢和积累能力,并且对肌细胞脂肪酸异化代谢有激活作用;3)两种鱼类均对饱和脂肪酸有相似的代谢能力,是肌肉良好的供能底物,但也易在肝脏中积累造成过度蓄积,对鱼类健康产生不利影响。